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一气呵成，Hieff Clone攻无不 克
------克隆新思路，给你好看
Yeasen Hieff CloneTM 一步法克隆试剂盒荣登SCI*期刊:《Cell》《Science》.
详情点击：http://www.yeasen。。ｃｏｍ/CompanyNews/1930.htm
http://www.yeasen。。ｃｏｍ/CompanyNews/1951.htm
基于限制性内切酶和T4 DNA连接酶的经典分子克隆技术，易出现假阳性，克隆效率不高。此外，该技术受到多种实验因素的限制，包括酶切位点的选择、插入片段制备繁琐、T4 DNA连接酶序列的偏好性、连接反应时间长等。
提高克隆效率的关键，增加配对碱基数
图1. 几种克隆方法连接效率的比较
翊圣生物经数年潜心研究，精益求精。摸索与优化反复循环，实现了 末端同源重组技术 由理论到应用的升级，研发出Hieff CloneTM系列克隆产品。该系列产品克隆效率显著提升，可达95%以上。基于同源重组的方式，该系列产品无需考虑酶切位点，适用于任何载体和任意片段的连接。同时兼具连接反应时间短（20 min）、操作简单等优势。
非凡匠心，带来*品质
翊圣生物在成熟的工具酶表达纯化平台基础上，获得高纯度重组酶，并反复优化重组酶反应微环境，保证Hieff CloneTM克隆试剂盒的zui佳品质。它可以将任意线性化载体和具有与其两端20 bp左右同源序列的DNA片段快速定向克隆。Hieff CloneTM克隆试剂盒简便、快速、，是无缝克隆的。
产品优势
● 无需考虑酶切位点：不受插入片段酶切位点的限制，适用于任何载体；插入片段兼容粘性或平末端。
● 设计简单：在插入片段的PCR扩增引物5 端引入20 bp左右与载体末端同源的序列即可。
● 快速：50℃，20 min即可完成重组反应。克隆阳性率可达95%以上。
● 应用广泛：可用于单片段或多片段定向克隆，也可结合Canace高保真酶，应用于定点突变。
方法对比
方法
目的片段制备步骤
酶切位点
通用性
连接时间
阳性率
一步法同源重组
仅需1步
不受目的片段限制
高
20 min
95%以上
传统酶切酶连
需要2步
受到目的片段限制
低
过夜
不同基因差别大
实验流程
Hieff CloneTM一步法快速定向克隆试剂盒分为单片段克隆和多片段克隆试剂盒，实验流程见下图。
图2：Hieff CloneTM一步法快速定向克隆试剂盒进行单片段和多片段克隆实验流程图。
①线性化载体的制备：酶切或PCR制备线性化载体。②插入片段的制备：在目的DNA片段上下游引物的5 端引入20 bp左右载体末端同源序列；PCR反应扩增目的片段。③重组反应：按比例混合线性化载体和目的DNA片段进行重组，50℃反应20 min。④转化、涂板：将重组产物直接转化后涂平板。挑取克隆。
产品数据
★ 单片段重组
图3：Hieff CloneTM One Step Cloning Kit可以有效克隆不同长度的单片段基因。
A-D：重组转化平板。E：插入片段和载体浓度检测电泳图。F-H：插入片段PCR鉴定电泳图。箭头指示目的条带。载体：pFastBac1，4.7 kb，插入片段大小分别是1.2 kb，3 kb和5 kb，载体与插入片段摩尔比：1:3，重组反应条件：50℃，20 min。
★ 多片段轻松重组
图4：Hieff CloneTM Plus Multi One Step Cloning Kit进行三片段克隆。
A：重组转化平板。B：插入片段和载体浓度检测电泳图。C：PCR方法鉴定每个单片段和zui终连接基因。箭头指示目的条带。载体：pCAMIBA1302，10 kb，三个插入片段长度：1 kb，1.5 kb和2.5 kb，重组反应条件：50℃，20 min。
★ 载体与插入片段摩尔比1:3左右zui适
图5：Hieff CloneTM One Step Cloning Kit进行单片段和载体不同摩尔浓度比例重组克隆测试。
A-C：重组转化平板。载体与插入片段的分子摩尔数比分别是1:2（A），1:3（B）和1:4（C），重组反应条件：50℃，20 min。
★ 重组反应时间20-30 minzui佳
图6：Hieff CloneTM One Step Cloning Kit进行不同重组反应时间克隆测试。
A-C：重组转化平板。重组反应时间分别是20 min（A），25 min（B）和30 min（C），重组反应温度：50℃。
客户体验专区
率重组实验信息：载体大小：10217 bp；目的片段大小：2352 bp。
图7：使用Hieff CloneTM Plus One Step Cloning Kit进行克隆，克隆阳性率100%。
A：阴性对照转化平板。B：重组质粒转化平板。C：1和2分别为原始载体和线性化载体浓度检测电泳图。D：目的片段的浓度检测电泳图。E：目的片段的菌落PCR鉴定电泳图。F：1为重组质粒的酶切鉴定电泳图，2为原始质粒酶切对照图。M：DL10000. (南京农业大学)
长片段重组实验信息：载体大小：8000 bp，目的片段大小：7500 bp。
实验数据：
图8：使用Hieff CloneTM Plus One Step Cloning Kit进行克隆。
A：阴性对照转化平板。B：重组质粒转化平板。C：载体和目的片段的浓度检测电泳图。D：菌落PCR鉴定电泳图，箭头指示目的条带。 M1：Marker Ⅲ；M2：100 bp DNA ladder。(仁济医院)
短片段重组实验信息：载体大小：5500 bp；目的片段大小：59 bp。
实验数据：
图9：使用Hieff CloneTM Plus One Step Cloning Kit进行克隆。
A：阴性对照转化平板。B：重组质粒转化平板。C：载体浓度检测电泳图。D：克隆测序对比图，为阳性结果。M：Trans 2K plus II DNA ladder.(中国农业科学院)
多片段重组实验信息：载体大小：3996 bp；四个片段大小：576 bp，867 bp，915 bp和647 bp。
实验数据：
图10：使用Hieff CloneTM Multi One Step Cloning Kit进行克隆。
A：重组质粒转化平板。B：1为载体酶切后琼脂糖凝胶电泳图。C：菌落PCR验证结果，其中1为原始质粒对照电泳，2-5为重组质粒，仅检测863bp的一个目的片段，6为假阳性。D：阳性克隆测序结果。M：Marker II。（微生物所)
◆ 低浓度载体重组
实验信息：载体大小： 4700 bp，目的片段大小：1600 bp。
实验数据：
图11：使用Hieff CloneTM Plus One Step Cloning Kit进行克隆。
A：重组转化平板。B：载体浓度检测电泳图。C：插入片段浓度检测电泳图。D：克隆基因PCR鉴定电泳图。箭头指示目的条带。载体浓度：5 ng/ L，插入片段浓度：25 ng/ L，载体与插入片段摩尔比例为1:2，重组反应条件:50℃，20 min。(西南大学)
高性价比
图12：Hieff CloneTM Plus Multi One Step Cloning Kit与不同品牌的同类产品相比，显示出更高的性价比
客户使用情况
已得到广大用户认可 使用客户数量600+
主要有：中国科学院上海生命科学研究院，北京大学，中国农业大学，清华大学生命科学学院，华东理工大学，上海交通大学，复旦大学，华中农业大学，浙江大学，中国药科大学，武汉大学，中山大学，东南大学，南京林业大学，华南农业大学，南京农业大学，南方医科大学，山西师范大学，中国农业科学院中国水稻研究所，中国科学院水生生物研究所，暨南大学，中科院健康科学研究所，中国科学院动物研究所，华东师范大学，同济大学，中国科学院微生物研究所，第二军医大学，上海市东方医院，上海植物逆境生物学研究中心，中国农业科学院上海兽医研究所，中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所，浙江大学医学院附属第二医院，中国科学院植物研究所，中国科学院南京土壤研究所，中国科学院遗传与发育生物学研究所，中国科学院上海有机化学研究所，中国科学院生物物理研究所，中国科学院南海海洋研究所，中国林科院亚热带林业研究所，浙江省农业科学院等单位的课题组。
常见问答
Q：Hieff CloneTM克隆的原理是什么？
A：利用末端同源重组的原理。将任意线性化载体和具有与其两端20 bp左右同源序列的DNA片段快速定向克隆。
Q：与传统克隆相比，Hieff CloneTM克隆有什么优势？
A：1）无需考虑酶切位点：不受插入片段酶切位点的限制，适用于任何载体；插入片段兼容粘性或平末端。
2）设计简单：在插入片段的PCR扩增引物5 端引入20 bp左右与载体末端同源的序列即可。
3）快速：50℃，20 min即可完成重组反应。克隆阳性率可达95%以上。
4）应用广泛：可用于单片段或多片段定向克隆，也可结合Canace高保真酶，应用于定点突变。
Q：同源序列长度对重组效率的影响？
A：同源序列的长度与克隆数目有相关性，一般同源片段选择在20 bp左右，可以在15 bp-25 bp范围内调整。并且选择尽量避免出现二级结构。
Q：线性化载体和目的片段产物的质量会影响重组反应吗？
A：线性化载体或目的片段品质较差时会极大影响重组反应，建议割胶回收纯化产物。
Q：一步法快速定向克隆试剂盒对感受态细胞有要求吗？
A：推荐使用转化效率为108 cfu/ g的感受态细胞。如Yeasen的DH5 （cat NO. 11802ES），*0（cat NO. 11801ES）等。
Q：线性化载体和目的片段扩增产物的使用量和比例？
A：载体使用量应大于0.01 pmol，推荐使用量0.03 pmol；克隆载体与目的片段摩尔比应在2:1-1:5范围内，zui适为1:2-1:3，超过范围可能会影响克隆效率。
Q：一步法快速定向克隆试剂盒适用实验有哪些？
A：本试剂盒适用于绝大多数基于常规 酶切-连接 方法的克隆实验，并且特别适用于其它常规方法难以快速实现的基因多点突变、全基因合成等。
Q：多片段一步法快速定向克隆试剂盒可以用于单片段的克隆吗？
A：多片段一步法克隆试剂盒可以用于单片段的克隆。但是，单片段克隆试剂盒不建议用于多片段的克隆，重组效率可能会受到影响。
Q：一步法快速定向克隆试剂盒反应温度是50℃，是否可以在37℃进行反应？
A：一般情况下建议在50℃进行反应。50℃有利于消除DNA的二级结构，同时是Hieff CloneTM重组酶的zui适反应温度。37℃反应条件也可以进行重组反应，请根据实验需要进行优化。
产品发表文献
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