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MB10103.5 v.A
植物琥珀酸脱氢酶活性比色法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）
主要用途
植物琥珀酸脱氢酶（SDH）活性比色法定量检测试剂是一种旨在使用合成电子受体染料，通过反应系统测定染料还原后峰值的降低，即采用比色法测算样品中单位酶活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种植物组织，包括种子（seed）、叶片（leaf）、根（root）等裂解悬液中琥珀酸脱氢酶的特异性活性检测。用于衰老、能量代谢、蛋白组学等研究。产品不含污染性蛋白酶，严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，反应优化，检测敏感。
技术背景
琥珀酸脱氢酶（succinate dehydrogenase；SDH；EC 1.3.99.1）是三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle；TCA）或Krebs循环中与细胞线粒体膜相关的重要元素，位于线粒体内膜，参与细胞呼吸链。琥珀酸脱氢酶由27kd和70kd两个单体组成。其功能在于催化琥珀酸（succinate）的氧化反应，产生延胡索酸（furmarate），通过黄素腺嘌呤二核苷酸（Flavin Adenine Dinucleotide；FAD）传递电子。基于琥珀酸脱氢酶的反应原理，使用人工电子受体染料二氯靛酚钠（2,6-Dichloroindophenol sodium；DCIP），接受来自还原型黄素腺嘌呤二核苷酸（Reduced flavin Adenine Dinucleotide；FADH2）的电子，而被还原，在分光光度仪下，其吸光值（600nm波长）的变化，来测算琥珀酸脱氢酶的活性。其反应方式为：
产品内容
清理液（Reagent A） 毫升
裂解液（Reagent B） 毫升
缓冲液（Reagent C） 毫升
反应液（Reagent D） 毫升
底物液（Reagent E） 毫升
阴性液（Reagent F） 微升
产品说明书 1份
保存方式
保存 清理液（Reagent A）和 缓冲液（Reagent C）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里，避免反复冻融； 反应液（Reagent D）含有毒性物质，避免直接用手接触； 底物液（Reagent E），避免光照，有效保证6月
用户自备
15毫升锥形离心管：用于样品制备的容器
1.5毫升离心管：用于样品制备和保存的容器
DOUNCE匀浆器：用于组织匀化
4℃（微型）台式离心机：用于样品处理
恒温培养箱或恒温水槽：用于反应物孵育
比色皿：用于比色测定的容器
分光光度仪：用于比色分析
实验步骤
实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的试剂溶液置入冰槽里融化； 底物液（Reagent E）注意避光。然后进行下列操作。
一、样品准备
准备好新鲜的植物组织（叶片、谷粒、种子等），并秤重以确定1克组织重量 （选择步骤）放进预冷的15毫升锥形离心管（选择步骤）加入xx毫升 清理液（Reagent A）清洗1次即刻用刀片切碎组织放进一个预冷的15毫升锥形离心管加入预冷的xx毫升 裂解液（Reagent B）涡旋震荡5秒，充分混匀即刻放进预冷的DOUNCE匀浆器，在冰槽里用研磨棒匀化组织（约80下）将所有组织匀浆物移入1.5毫升离心管，放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为5000g（或7500RPM，例如eppendorf 5415）小心移出上清液（注意：不要触碰沉淀物）到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管（选择步骤）如果上清液含有肉眼可见的残渣，重复离心5分钟一次，速度为5000g（或7500RPM，例如eppendorf 5415）即刻移入到1.5毫升离心管移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）放进－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里备用
二、测定准备
准备好待测样品，置于冰槽里 设定好分光光度仪（温度为25℃）：波长600nm，间隔60秒，读数6次（共5分钟），并置零
背景对照测定
移取xx微升 缓冲液（Reagent C）到新的比色皿加入xx微升 反应液（Reagent D）加入xx微升 底物液（Reagent E）放进25℃培养箱里静置3分钟加入xx微升 阴性液（Reagent F）上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照：OD0分钟－OD5分钟
样品活性测定
移取xx微升 缓冲液（Reagent C）到新的比色皿加入xx微升 反应液（Reagent D）加入xx微升 底物液（Reagent E）放进25℃培养箱里静置3分钟加入100微升待测样品（注意：100微克组织总蛋白；样品须溶解）上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）即刻放进分光光度仪检测，此为样品总活性读数：OD0分钟－OD5分钟
计算样品活性
注意事项
本产品为20次操作，包括背景对照测定操作时，须戴手套 反应液（Reagent D）含有毒性物质，避免直接用手接触系统操作过程中，背景测定只需1次加入样品后3秒内即刻比色测定比色测定初始读数（0分钟读数）0.8左右为理想状态反应1分钟后比色测定值趋于稳定；测定值由高到低变化；测定持续5分钟测定值由高到低变化，即5分钟测定读数低于0分钟测定读数，表明有酶活性比色测定后，比色皿须清洗彻底建议待测样本组织总蛋白浓度为100微克/100微升；如果样本酶活性过低或过高，则可以增加或降低样本量；注意计算公式的调整（本公司提供 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒GMS30030.1）活性计算时，可以选择5分钟内单位时间zui大线性变化的吸光值琥珀酸脱氢酶单位活性定义为：在25℃，pH 7.5条件下，每分钟内能够还原1微摩尔氧化型二氯靛酚钠（DCIP）所需的酶量作为一个活性单位本公司提供系列细胞酶学技术产品
质量标准
本产品经鉴定性能稳定本产品经鉴定检测准确
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