细胞膜完整性及膜转运功能检测实验_91化工仪器网

区分活细胞和死亡细胞的关键在于死亡细胞膜转运功能及膜完整性的丧失。许多阳离子染料，如台盼蓝、碘化丙锭（PI）、溴化乙锭（EB）以及7-氨基放线菌素D（7-ADD）等，常被用于检测细胞的存活率。活细胞由于膜具有完整性而不被着色，死亡细胞（如坏死细胞或晚期凋亡细胞）由于其膜完整性的丧失而被着色。
实验方法原理   
实验步骤   
1. 主要试剂的的配制
碘化丙锭（PI）染色液（4℃ 避光保存）：Pl，100 g/ml；TritonX-100，1.0%；NaCl 0.9%。

2. 操作流程
2.1 样本的准备

2.1.1 培养细胞收集悬浮细胞于 Eppendorf 管中。贴壁细胞用胰蛋白酶消化后制成单细胞悬液，1000r/min离心 5 min。

2.1.2 新鲜实体组织取材组织用 PBS 漂洗干净后，浸泡在含 PBS 的平皿或青霉素小瓶内，用眼科剪尽可能将组织剪碎，吸去上清液，组织块转入大瓶中加入 10～20 ml 酶（200 g/ml胶原酶），37℃ 消化 30 min，在不锈钢网上轻轻研磨，使组织和细胞分离，用 200 目筛网过滤 2 次。

2.1.3 石蜡切片组织切 50 m 厚切片 4 张，置玻璃试管中，加二甲苯 5 ml，脱蜡 3 5 min，无水乙醇洗3 5 min，蒸馏水洗 5 min，加 2 ml 0.5% 胃蛋白酶（pH 1.0），振荡消化 30 min，PBS 洗终止消化，后用 200 目筛网过滤2次。

2.2 染色方法
制备好的单细胞悬液可用70% 乙醇固定，4℃ 保存备用。染色前用PBS稀释单细胞，离心沉淀，弃上清，加入 200 l RNA 酶 A，37℃ 水浴30 min，再加入 800 l PI 染色液，混匀，4℃ 避光孵育 30 min。

2.3 上机检测记录
激发波长 488 nm 处红色荧光。

3. 结果观察
细胞凋亡时，G1 峰左侧出现亚二倍体细胞群的峰型。在光散射图谱上，前向光散射低于正常，侧向光散射高于正常。细胞坏死时，细胞周期中的细胞均出现不同程度的减少，亚二倍体细胞量多少不等。在光散射图谱上，的向光散射和侧向光散射均高于正常。

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