12302ESHieff NGS-TM DNA Quantification Kit for Illumina_分子生物学-上海翊圣生物科技有限公司

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本产品是用于lllumina 平台高通量测序文库浓度定量的专用试剂盒，提供定量所需的DNA标准品、qPCR Master Mix、定量扩增引物和参比染料ROX。其中，DNA标准品包含经梯度稀释的六份450 bp的双链DNA溶液，浓度为20 pM-0.0002 pM；扩增引物对根据NGS文库接头序列P5和P7设计，可保证特异性扩增双端接头完整的文库分子。 【详细说明】

Hieff NGSTM DNA Library Quantification Kit for Illumina

产品信息

产品名称

产品编号

规格

储存

价格（元）

Hieff NGSTM Library Quantification Kit for Illumina , qPCR Master Mix

12302ES05

500 T

-20℃

1526.00

Hieff NGSTM Library Quantification Kit for Illumina , DNA Standard 1-6

12307ES09

6 96 L

-20℃

2126.00

产品描述

本产品是用于lllumina 平台高通量测序文库浓度定量的专用试剂盒，提供定量所需的DNA标准品、qPCR Master Mix、定量扩增引物和参比染料ROX。其中，DNA标准品包含经梯度稀释的六份450 bp的双链DNA溶液，浓度为20 pM-0.0002 pM；扩增引物对根据NGS文库接头序列P5和P7设计，可保证特异性扩增双端接头完整的文库分子；qPCR Master Mix是基于抗体法热启动的染料法qPCR预混液，可在不同长度、不同GC或AT含量样本中高效、特异扩增，实现精确定量。

本试剂盒已经过严格的质量和功能检测，试剂盒所有组分均达到DNA污染控制的严格质控要求，应用于NGS文库定量精确灵敏，且批间稳定，结果重现性优异。

产品组分

组分名称

规格

12302ES05

12307ES09

Hieff NGSTM SYBR qPCR Master Mix (2 )

5 1 mL

--

qPCR Primer Mix

600 L

--

Rox (25 M)

200 L

--

Rox (250 M)

200 L

--

DNA Standards 1-6

6 96 L

--

注意：

1. 根据仪器类型选择合适的参比染料ROX。

类别

机型

不添加ROX

Bio-Rad CFX96 , CFX384 , iCycler iQ , iQ 5, MyiQ , MiniOpticon , Opticon , Opticon 2, Chromo4 Cepheid SmartCycler ; Eppendorf Mastercycler ep realplex, realplex 2 s; Illumina Eco qPCR; Qiagen/Corbett Rotor-Gene Q, Rotor-Gene 3000, Rotor-Gene 6000; Roche Applied Science LightCyclerTM480; Thermo Scientific PikoReal Cycler.

添加Rox (250 M)

Applied Biosystems 5700, 7000, 7300, 7700, 7900, 7900HT, 7900HT Fast; StepOne , SteponePlus .

添加Rox (25 M)

Applied Biosystems 7500, 7500 Fast, ViiA 7; Stratagene MX4000 , MX3005P , MX3000P

2. qPCR Primer Mix 中包含一对引物，序列如下，可预先通过引物序列确认文库是否可以被该引物对扩增。

Primer 1：5 -AAT GAT ACG GCG ACC ACC GA-3

Primer 2：5 -CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA-3

运输与保存方法

冰袋运输。所有组分应-20℃保存，qPCR Master Mix与ROX避光保存，效期6个月；如短期内反复使用，qPCR Master Mix可解冻后于4℃避光暂存，效期3个月。

注意事项

一、关于操作

1. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

2. 请于使用前确保产品冻融和彻底混匀，短暂离心收集至管底后置于冰上备用。

3. 为保证产品品质，避免反复冻融超过30次！

4. 为避免样品交叉和气溶胶污染，推荐使用带滤芯的枪头，吸取不同样品时请更换枪头。

5. 试剂吸取时应保证枪头适当深入液体，排出时应确认枪头无残留。

二、关于文库稀释

文库需稀释至标准曲线有效Ct范围内进行定量，稀释比例可参照过往经验或使用其他测定方式测定的浓度作为参考（如NanoDrop ，Qubit 或Bioanalyzer）。使用本试剂盒可定量的文库浓度范围参见下表。

由于DNA在非缓冲环境中易降解，因此应使用缓冲稀释液（10 mM Tris-HCl，pH 8.0 [25℃] + 0.05% Tween 20）稀释文库，切勿使用水作为稀释液。测定时，文库应现测定现稀释，置于冰上待测，切勿使用以往配制的储存的稀释后文库。

表1  DNA Standard浓度

DNA Standard

摩尔浓度

质量浓度

拷贝数浓度

Std 1

20 pM

5.5 pg/ L

12 106 copies/ L

Std 2

2 pM

0.55 pg/ L

12 105 copies/ L

Std 3

0.2 pM

0.055 pg/ L

12 104 copies/ L

Std 4

0.02 pM

0.0055 pg/ L

12 103 copies/ L

Std 5

0.002 pM

0.00055 pg/ L

12 102 copies/ L

Std 6

0.0002 pM

0.000055 pg/ L

12 101 copies/ L

三、污染与阴性对照（Contamination and No-template Controls）

1. 进行qPCR实验时，应保证良好的实验操作规范，以防对工作区域、试剂、耗材、仪器、DNA标准品等造成污染。推荐将反应体系配制区和模板制备区进行物理隔离，并定时使用0.5%次氯酸钠或10%漂白剂对各实验区域进行擦拭清理。

2. 反应体系配制过程中DNA Standards的加入应按照从低浓度至高浓度（DNA Standard 6至1）的顺序进行，每次移液都应更换新的枪头，以避免气溶胶污染。

3. 每次实验都应平行进行NTC阴性对照反应，配合融解曲线进行扩增特异性和体系污染程度分析。因扩增引物序列为Illumina 平台固定序列而非qPCR专用引物序列，且扩增循环数较多，NTC阴性对照反应出现引物二聚体扩增进而产生Ct属正常情况。正常情况下Ct (NTC) Ct (DNA Standard 6) + 3。

四. 扩增曲线基线设置

因DNA Standard 1的摩尔浓度远远高于常规qPCR模板，其Ct往往非常小。而大部分qPCR仪器都默认将3-15循环设置为基线（baseline），有时会将DNA Standard 1的Ct值误认为是测定时的噪声背景，继而影响标准曲线制作。手动设置基线（baseline）为1-3循环可以有效避免这种情况发生。

五、文库长度矫正

为避免片段长度对文库定量的影响，需要在定量结果计算时，对文库长度进行矫正。根据文库荧光染料SYBR  Green I结合DNA后产生的荧光强度与DNA分子量成正比的原则，根据以下公式进行文库浓度长度矫正。

矫正后的稀释文库浓度（pM）= [450 bp /文库平均长度（bp）]  稀释文库的浓度（pM）

六、融解曲线分析

融解曲线在配合NTC阴性对照进行污染程度分析以及确认标准曲线zui大有效Ct时至关重要，推荐每次实验都进行融解曲线采集步骤。本产品，DNA Standards产生的熔解曲线呈现特征单峰。

 

图1 文库标准品熔解曲线

使用方法

一、解冻试剂

将Hieff NGSTM qPCR Mix，Primer Mix，DNA Standards 1-6，文库稀释液（10 mM Tris-HCl, pH 8.0 + 0.05% Tween 20），ROX Dye（如需要）从冰箱中拿出，冰浴解冻。各试剂解冻后，涡旋混匀，短暂离心后置于冰上备用。

二、稀释文库

使用文库稀释液（10 mM Tris-HCl，pH 8.0 [25℃] + 0.05% Tween 20）对待测文库进行适当稀释。推荐稀释度为1:1000-1:100000。对于高浓度文库，可额外设置3个2倍稀释梯度，如按1:1000稀释文库，可额外设置1:2000，1:4000，1:8000稀释比例，以保证测定值在试剂盒所提供的标曲范围内。

三、反应体系配制

于反应管中配制如下体系，上下颠倒或涡旋振荡混匀，并短暂离心将反应液收集至管底。

表2 qPCR反应体系

名称

体积

Hieff NGSTM SYBR qPCR Master Mix（2 ）

10  L

qPCR Primer Mix

1  L

Diluted DNA Library/DNA Standard 1-6/ddH2O*

2  L

ddH2O

7  L

Total

20 L

注：1）每个反应至少设置3个平行；2）推荐进行20 L反应体系，如需进行10 L反应，则将体系各组分等比减少；3）*在阴性对照反应管中加入ddH2O；在样品反应管中加入稀释后的文库；在标准曲线反应管中加入DNA Standards；4）根据机型添加合适ROX，推荐加入量0.5 L。

四、qPCR运行程序

将反应管置于qPCR仪中，按下述条件设置qPCR反应程序，并运行（熔解曲线可根据仪器默认即可）。

表3 qPCR程序

步骤

温度

时间

循环数

预变性

95℃

5 min

1 cycle

循环反应

95℃

10 sec

40 cycles

60℃

45 sec*

熔解曲线

95℃

15 sec

1 cycle

60℃

60 sec

95℃

15 sec

注：*当文库平均长度 700 bp时，建议延伸时间延长至90 sec。

五、数据分析

1. 标准曲线制作

1）根据复孔间Ct差异 0.2的原则，对DNA Standards原始Ct进行过滤，并计算平均Ct。

2）使用有效范围内的Ct（作为纵坐标）和Log[pM]（作为横坐标）绘制标准曲线。参照NTC阴性对照Ct确认标准曲线Ct有效范围。

如Ct (NTC) Ct (DNA Standard 6) + 3，则zui大有效Ct为Ct (DNA Standard 6)，应使用DNA Standard 1-6所产生的Ct绘制标准曲线；

如Ct (DNA Standard 6) + 3 Ct (NTC) Ct (DNA Standard 5) + 3，则zui大有效Ct为Ct (DNA Standard 5)，应使用DNA Standard 1-5所产生的Ct绘制标准曲线；

如Ct (DNA Standard 5) + 3 Ct (NTC) Ct (DNA Standard 4) + 3，则zui大有效Ct为Ct (DNA Standard 4)，应使用DNA Standard 1-4所产生的Ct绘制标准曲线；

基于定量准确性考虑，请至少使用4个Ct (DNA Standards)绘制标准曲线。如Ct (DNA Standard 4) + 3 Ct (NTC)，提示定量体系存在严重污染，需更换体系中所有组分后重复试验。

3）绘制的标准曲线相关系数R2应不低于0.99，斜率应位于-3.1至-3.6之间（表示扩增效率位于90%-110%之间）。如标准曲线参数不佳，应重复试验。

2. 文库浓度计算

稀释文库的Ct只有位于标准曲线有效Ct范围之内才可用于浓度计算，同时应对文库进行长度矫正。可根据下述公式计算原始文库浓度（nM）：

原始文库浓度（nM）= [450 bp /文库平均长度（bp）] 稀释文库的浓度（pM） 稀释倍数/1000

六、使用案例

用Hieff NGSTM DNA Library Quantification Kit for Illumina 定量嗜盐杆菌基因组DNA文库，文库GC含量为70%，长度450 bp。将文库稀释10000倍上机检测，结果如下图所示。根据标曲及公式，文库终浓度=4.37 pM  稀释倍数10000=43.7 nM。

 

图2  文库qPCR精确定量

常见问题

问题

可能原因与解决方法

扩增效率不在90%-110%

1. 如Ct (NTC) - Ct (DNA Standard 6) 3或者Ct (DNA Standard 6) - Ct (DNA Standard 5) 3.1，且计算扩增效率超过100%，提示反应体系有污染。应根据NTC阴性对照的融解曲线确认污染源（文库污染或DNA Standards污染）。

2. 不恰当的基线基线（baseline）设置。手动调整基线（baseline）为1-3循环。

3. 移液精确度差，重复实验，确保所有试剂使用前完全溶解并混匀。

相关系数R2  0.99

1. 移液精确度差，重复实验，确保所有试剂使用前完全溶解并混匀。

2. 仪器相关问题，确保仪器与ROX匹配使用。

标曲扩增曲线分布不均一

1. Ct (DNA Standard 6) - Ct (DNA Standard 5) 3.1，提示反应体系有污染。根据NTC

阴性对照的融解曲线确认污染源（文库污染或DNA Standards污染）。

2. Ct (DNA Standard 2) - Ct (DNA Standard 1) 3.1，提示基线基线（baseline）设置不当。手动调整基线基线（baseline）为1-3。

3. DNA Standards之间的 Ct 3.6，提示扩增效率差。确认所有试剂在使用前都已充分解冻并彻底混匀；确认所有组分浓度正确以及反应程序无误。

4. 长时间强光照射会导致qPCR Master Mix荧光值下降，进而造成 Ct 3.6。应按照推荐方式避光贮存试剂。

复孔重复性差

1. 移液精确度差，重复实验，确保所有试剂使用前完全溶解并混匀。

2. 仪器相关问题，确保仪器与ROX匹配使用。

文库稀释液 Ct不在合理范围（如2倍稀释文库， Ct为0.9-1.1）

1. 移液精确度差，重复实验，确保所有试剂使用前完全溶解并混匀。

2. 文库难于扩增。GC/AT含量过高或长度超过1 kb的文库扩增效率较差。

3. 文库降解。文库应现用现稀释，稀释好的文库应置于冰上备用。

文库各稀释度计算的初始文库浓度差异超过10%

1. 移液精确度差，重复实验，确保所有试剂使用前完全溶解并混匀。

2. 文库难于扩增。GC/AT含量过高或长度超过1 kb的文库扩增效率较差。

3. 文库降解。文库应现用现稀释，稀释好的文库应置于冰上备用。

稀释文库Ct值不在标曲Ct的有效范围

1. 使用有效范围内的Ct值计算文库浓度。当Ct (稀释文库) Ct (DNA Standard 1)，提示文库稀释度不够，应提高文库稀释倍数重复实验。

2. Ct (稀释文库) Ct (DNA Standard 6)，提示文库稀释度过高，应减少稀释倍数重复实验。

3. 推荐稀释度为1:1000-1:100000。对于高浓度文库，可额外设置3个2倍稀释梯度，如按1:1000稀释文库，可额外设置1:2000，1:4000，1:8000稀释比例，以保证测定值在试剂盒所提供的标曲范围内。

DNA Standard 1扩增曲线异常

不恰当的基线基线（baseline）设置。手动调整基线（baseline）为1-3循环。

DNA Standards有扩增，而文库没有或Ct很大

1. 文库接头序列错误。核对文库末端序列与试剂盒提供的引物序列是否匹配。

2. 稀释度过高。减少稀释倍数，重复实验。

3. 文库降解。文库应现用现稀释。

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版本号：HB180530