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货号：YJ2218 规格：50管/24样
Na+ K+-ATP 酶活性测定说明书
可见分光光度法
正式测定前务必取 2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
Na+ K+- ATP 酶广泛分布于植物、动物、微生物和细胞中，可催化ATP水解生成 ADP和无机磷。
测定原理：
Na+ K+-ATP 酶分解ATP生成ADP及无机磷，通过测定无机磷的量来确定 ATP 酶活性。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸
馏水。
试剂的组成和配制：
提取液：液体 50mL 1 瓶，4℃保存。
试剂一：液体 10mL 1 瓶，4℃保存。
试剂二：液体 5mL 1 瓶，4℃保存。
试剂三：液体 5ml 1 瓶，4℃保存。
试剂四：粉剂 3支，-20℃保存。用时每支加1mL蒸馏水，现用现配。用不完的试剂-20℃
可保存一周。
试剂五：液体 5mL 1 瓶，4℃保存。
试剂六：粉剂 1 瓶，4℃保存。用时加入 3mL 蒸馏水， 4℃保存。
试剂七：粉剂 1 瓶, 4℃保存。用时加入 25mL 蒸馏水，溶解后 4℃保存一周。
试剂八：粉剂 1 瓶, 4℃保存。用时加入 25mL 蒸馏水，溶解后 4℃保存一周。
试剂九：液体 25mL 1 瓶，室温保存。
试剂十：10mmol/L 标准磷贮备液 10mL 1 瓶，4℃保存。
0.5 mol/mL标准磷应用液配制：将贮备液20倍稀释，即取0.1mL试剂十加1.9mL蒸馏水
充分混匀。
定磷剂的配制：按 H2O: 试剂七:试剂八:试剂九=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷剂应为浅黄色。若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染，定磷剂现用现配。
样品酶液的制备：
1、细菌、细胞或组织样品的制备：
细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2、血清（浆）样品：直接检测。
操作步骤
1、分光光度计预热 30min以上，调节波长至660nm，蒸馏水调零。
2、酶促反应（在 EP 管中加入下列试剂）
对照管
测定管
试剂一（ L）
130
90
试剂二（ L）
40
40
试剂三（ L）
40
40
试剂四（ L）
40
40
试剂五（ L）
40
样本 （ L）
200
混匀，37℃（哺乳动物）或 25℃（其他物种）准确水浴 10min
试剂六（ L）
50
50
样本 （ L）
200
混匀，8000g，25℃离心 10min，取上清液
3 定磷(在 1.5mLEP 管中依次加入下列试剂)
空白管
标准管
对照管
测定管
0.5 mol/ml 标准磷
应用液（ L）
100
上清液（ L）
100
100
蒸馏水（ L）
100
定磷试剂（ L）
1000
1000
1000
1000
混匀，室温放置 30 min，在 660nm 处比色。
注意：
1、由于每一个样都必须做对照，本试剂盒50管保证测24份 Na+ K+ -ATP 酶。
2、此法具有微量、灵敏、快速的特点。所以对测定所用试管要求严格无磷。
3、空白管和标准管只要做一管。
计算
1、血清（浆）Na+ K+-ATPase 活力的计算:
定义：每小时每毫升血清（浆）中 Na+ K+-ATP 酶分解ATP产生1 mol无机磷的量为一个酶活力单位。
Na+ K+-ATP酶活力（ mol/h/mL）=[C标准管 V总] （A测定管-A对照管） （A标准管-A
空白管） V 样 T=7.5 （A 测定管-A 对照管） （A 标准管-A 空白管）
2、组织、细菌或细胞中 Na+ K+-ATPase 活力的计算：
（1）按蛋白浓度计算：
定义：每小时每毫克组织蛋白中 Na+ K+-ATP酶分解ATP产生1 mol无机磷的量为一个酶活力单位。
Na+ K+-ATP酶活力( mol/h /mg)= [C标准管 V总] （A测定管-A对照管） （A标准管-A 空白管） （Cpr V 样） T =7.5 （A 测定管-A 对照管） （A 标准管-A 空白管） Cpr
（2）按样本鲜重计算：
定义：每小时每克组织中Na+ K+ -ATP 酶分解ATP产生1 mol无机磷的量为一个酶活力单位。
Na+ K+-ATP 酶活力( mol/h/g)= [C标准管 V总] （A测定管-A 对照管） （A标准管-A 空白管） (W V 样 V 样总) T=7.5 （A 测定管-A 对照管） （A 标准管-A 空白管） W
（3）按细菌或细胞密度计算：
定义：每小时每1万个细菌或细胞中 Na+ K+-ATP 酶分解ATP产生1 mol无机磷的量为一个酶活力单位。
Na+ K+-ATP 酶活力( mol/h /104)= [C标准管 V总] （A测定管-A对照管） （A标准管-A空白管） (500 V样 V样总) T=0.015 （A测定管-A对照管） （A标准管-A空白管）
C 标准管：标准管浓度，0.5 mol/mL；V 总：酶促反应总体积，0.5mL；V 样：加入样本体
积，0.2mL ；V 样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，1/6 小时；Cpr：样本蛋白质
浓度，mg/mL；W：样本鲜重，g；500：细菌或细胞总数，500 万。
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