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EF39A\K4 2018-01版
黄曲霉毒素B1
快速检测试剂盒说明书
一、原理
本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，在微孔条上预包被偶联抗原，样本中的残留物黄曲霉毒素B1将和微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗黄曲霉毒素B1抗体，加入酶标记物后，用TMB底物显色，样本吸光值与其所含残留物黄曲霉毒素B1的含量成负相关，与标准曲线比较即可得出相应残留物黄曲霉毒素B1的含量。
二、试剂盒特性
试剂盒灵敏度： 0.02ppb孵育温度： 25℃孵育时间： 30min～15min样本检测下限饲料 大米、玉米、花生、组织、食用油 2 ppb
交叉反应率黄曲霉毒素B1 100%
黄曲霉毒素M1 6.6%
黄曲霉毒素B2 54.5%
黄曲霉毒素G1 8.4%
黄曲霉毒素G2 1.7%
样本回收饲料 大米、玉米、花生、组织、食用油 95 35%
试剂盒组成1
微量测试孔
每条8孔，一板12条
2
标准液 6瓶
（1ml/瓶）
0ppb
0.02ppb
0.06ppb
0.18ppb
0.54ppb
1.62ppb
3
酶标记物
7ml
红色帽
4
抗体工作液
7ml
蓝色帽
5
底物A液
7ml
白色帽
6
底物B液
7ml
黑色帽
7
终止液
7ml
黄色帽
8
20X浓缩洗涤液
40ml
白色帽
9
20X浓缩复溶液
50ml
透明帽
四、所用仪器、试剂
具备的仪器：酶标仪、均质器、振荡器、离心机、刻度移液管、天平（感量0.01g）、氮吹仪、恒温箱、打印机
微量移液器：单道 20～200 l、单道100～1000 l、多道 30～300 l
试 剂：甲醇、正己烷
五、样本前处理步骤
样本处理前须知（a）实验中必须使用一次性吸头，吸取不同试剂时要更换吸头。
（b）实验之前须检查各种实验器具是否干净，必要时可对实验器具进行清洁，以避免污染干扰实验结果。
样本前处理需配制：配液1 样本复溶液：
用去离子水将20 浓缩复溶液按1：19稀
释（1份20 浓缩复溶液+19份去离子水）。
配液2 样本提取液：
将甲醇与去离子水按7:3比例混合均匀（7份甲醇+3份去离子水）。
样本处理：（a）组织、饲料、大米、玉米样本处理方法：
取1.0 0.05g研碎的样本于50ml离心管中；加入5ml样本提取液，充分振荡3min，20℃ 4000r/min以上离心10min；取上清100 l，加入700 l样本复溶液，充分振荡混匀；取50 l用于分析。样本稀释倍数：40倍
（b）食用油样本处理方法：
取1.0 0.05g食用油样本于50ml离心管中；加入5ml样本提取液，再加入4ml正己烷，充分振荡3min，20℃ 4000r/min以上离心10min；去掉上清，取中间层液体100 l，加入700 l样本复溶液，充分振荡混匀；取50 l用于分析。样本稀释倍数：40倍
（c）花生样本处理方法：
取1.0 0.05g研碎的花生样本于50ml离心管中；加入5ml样本提取液，再加入4ml正己
烷，充分振荡3min，20℃ 4000r/min以上离
心10min；
去掉上清，取中间层液体100 l，加入400 l样本复溶液，充分振荡混匀；
3. 取50 l用于分析
样本稀释倍数：25倍
六、 酶标免疫分析程序:
测定前应须知：使用前将需用试剂和板条的温度回升至室温（20～25℃）。使用之后立即将所有试剂放回2～8℃。在ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，正确的洗板操作是ELISA测定程序中的要点。所有恒温孵育过程，避免光线照射，用盖板膜盖住微孔板。操作步骤：从2～8℃冷藏环境中取出所需试剂，室温（20～25℃）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。取出框架及需要数量的微孔，将不用的微孔放入自封袋，保存于2～8℃。配液：将40ml浓缩洗涤液（20倍浓缩）用去离子水按照1：19稀释（1份浓缩洗涤液+19份去离子水），或按所需用量配制洗涤液。编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。加标准品/样本50 l/孔到各自的微孔中，然后加酶标记物50 l/孔，再加入50 l/孔的抗体工作液，用盖板膜盖板，轻轻振荡混匀，25℃环境反应30min。将孔内液体甩干，用稀释后的洗涤液250 l/孔洗板4～5次，每次间隔15～30秒，用吸水纸拍干（拍干后未清除的气泡可用干净的枪头刺破）。显色：加入底物A液50 l/孔，再加入底物B液50 l/孔，轻轻振荡混匀，25℃环境中避光显色15min。测定：加入终止液50 l/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测，5min内读数），测定每孔OD值。七、结果判定
结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。注意样本吸光度值与其所含黄曲霉毒素B1量成负相关。
1、粗略判定：
用样本的平均吸光度值与标准值比较即可得出其浓度范围(ng/ml)。假设样本1的吸光度值为0.3，样本2的吸光度值为1.0，标准液吸光度值分别是：0ppb为2.243； 0.02pb为1.816；0.06ppb为1.415；0.18ppb为0.74；0.54ppb为0.313；1.62ppb为0.155。则样本1的浓度范围是0.54ppb～1.62ppb；样本2的浓度范围是0.06ppb～0.18ppb，乘以其对应的稀释倍数即为样本中黄曲霉毒素B1实际浓度。
2、定量分析
（1）百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的吸光度值的平均值（双孔）除以第一个标准（0标准）的吸光度值，再乘以100%，即
百分吸光率（%）＝
B
100%
B0
B 标准溶液或样本溶液的平均吸光度值
B0 0ng/ml标准溶液的平均吸光度值
（2）标准曲线的绘制与计算
以标准品百分吸光率为纵坐标，以黄曲霉毒素B1标准品浓度（ng/ml）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中黄曲霉毒素B1实际浓度。
若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样本的准确、快速分析。
八、 注意事项
室温低于25℃或试剂及标本未回到室温（20～25℃）会导致所有标准的OD值偏低。在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会伴随着标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。混合要均匀，否则会出现重复性不好的现象。反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。不要使用过了有效日期的试剂盒；稀释或搀杂使用会引起灵敏度、OD值变化；不要交换使用不同批号的盒中试剂。不用的微孔板放进自封袋重新密封；标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。标准品1的吸光度值小于0.5时，表示试剂可能变质。该试剂盒理想反应温度为25℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。九、储藏条件和保质期
储藏条件：试剂盒于2～8℃保存，不要冷冻。保 质 期：该产品有效期为1年，生产日期见包装盒。提示：酶标板真空包装袋若有漏气，酶标板仍然正常有效，不影响实验结果，请放心使用。
农业部生物毒素检测重点实室
联合研制
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