胞浆内钙离子浓度荧光（Fura

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文档简介 胞浆内钙离子浓度荧光（Fura-2）检测试剂盒产品说明书主要用途胞浆内钙离子浓度荧光（Fura-2）检测试剂是一种旨在通过线粒体钙离子特异性荧光探针Fura-2-AM，与钙离子结合后，其荧光强度显著增强，在荧光分光光度仪下测量不同激发波长下相对荧光峰值的比值，来测定细胞浆总钙离子浓度的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种活体细胞（动物、人体等）或冰冻切片组织细胞浆钙离子的浓度检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，检测敏感。技术背景钙是人体中的一种重要电介质和矿物质，占1150克。其中99％的钙以氟磷灰石钙（calciumfluorophosphateapatite）形式存在于骨组织中。非骨组织钙成分主要存在于细胞内。钙具有两种主要形式：一种是非弥散型蛋白结合钙，其构成约40％至50％的血清中的总钙含量；另一种为弥散型游离钙，其进一步分成具有活性的复合钙（complexedcalcium）和离子钙（ionizedcalcium）。钙对神经肌肉兴奋性（neuromuscularexcitability）、血液凝固、酶的激活、离子跨膜运输、释放神经传导介质、信使传导等方面起着重要作用。在细胞内，钙离子主要储存在线粒体和内质网等细胞器中。其中细胞浆钙离子在调节钙离子通道，维持细胞内环境钙离子平衡方面起着重要作用。细胞浆钙的检测包括沉淀法、EDTA鳌合滴定法、火焰光度法（flamephotometry）、原子吸收分光光度法等技术，但容易受到钠、钾、磷酸盐、硫酸盐的干扰，或者受限于仪器的特殊的要求，以及需要线粒体、细胞浆分离。Fura-2AM（acetoxy-methylester），一种具有细胞膜通透性，与钙离子结合产生荧光的染料，通过其不同激发波长340nm/380nm产生的荧光信号比（散发波长510nm）来精确测定细胞浆内钙离子水平。产品内容清理液（ReagentA）40毫升染色液（ReagentB）30微升介导液（ReagentC）600微升饱和液（ReagentD）2毫升阴性液（ReagentE）2毫升裂解液（ReagentF）200微升产品说明书1份保存方式保存染色液（ReagentB）和介导液（ReagentC）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；有效保证6月用户自备1.5毫升离心管：用于工作液配制的容器细胞培养箱：用于染色孵育96孔培养板：用于样品操作的容器荧光酶标仪：用于荧光分析（共聚焦）荧光显微镜：用于荧光染色观察实验步骤测定准备设定好荧光酶标仪：激发波长340nm和380nm，散发波长510nm测定开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的染色液（ReagentB）室温下融化，然后分别移出30微升介导液（ReagentC）和1.5微升染色液（ReagentB）到新的1.5毫升离心管，标记为染色工作液，并放在暗室里备用。然后进行下列操作。二、荧光酶标仪检测准备1个96孔细胞培养板，标记为：细胞样品孔、空白对照孔（不含细胞）、最大对照孔（含细胞）小心抽去细胞样品孔的培养液加入100微升清理液（ReagentA）到细胞样品孔里加入100微升饱和液（ReagentD）到最大对照孔里加入100微升阴性液（ReagentE）到空白对照孔里分别加入10微升染色工作液到所有孔里轻轻摇动酶标板，混匀放进37℃细胞培养箱里孵育60分钟，避免光照小心抽去细胞样品孔里的上清液小心加入100微升清理液（ReagentA）到细胞样品孔里重复实验步骤9和10一次放进37℃细胞培养箱里孵育30分钟加入5微升裂解液（ReagentF）到最大对照孔里放进37℃细胞培养箱里孵育15分钟即刻放进荧光酶标仪测读：获得相对荧光单位（relativefluorescenceunit；RFU）包括样品RFU340nm、样品RFU380nm、空白对照孔RFU340nm、空白对照孔RFU380nm、最大对照孔RFU340nm、最大对照孔RFU380nm计算样品细胞浆钙离子浓度【（样品RFU340nm/样品RFU380nm）－（空白对照孔RFU340nm/空白对照孔RFU380nm）÷（最大对照孔RFU340nm/最大对照孔RFU380nm－样品RFU340nm/样品RFU380nm）】X（空白对照孔RFU380nm/最大对照孔RFU380nm）X140（纳摩尔；解离常数）三、（共聚焦）或荧光显微镜检测1．准备1个待测的细胞爬片样品小心加上500微升清理液（ReagentA），覆盖样品表面小心移去样品上的清理液（ReagentA）移取300微升清理液（ReagentA）到新的1.5毫升离心管加入30微升染色工作液，混匀小心加上上述含有染色工作液的溶液到样品上，覆盖样品表面放进37℃细胞培养箱里孵育60分钟，避免光照小心移去样品上的染色工作液小心加上500微升新鲜的清理液（ReagentA）小心移去清理液（ReagentA）小心加上500微升新鲜的清理液（ReagentA）放进37℃细胞培养箱里孵育30分钟小心移去清理液（ReagentA）盖上盖玻片即刻在（共聚焦）荧光显微镜下进行观察：激发波长340至400nm，散发波长510nm（细胞浆钙离子呈现蓝色荧光）四、冰冻切片检测准备1个待测的冰冻切片小心加上500微升清理液（ReagentA），覆盖切片样品表面小心移去样品上的清理液（ReagentA）移取300微升清理液（ReagentA）到新的1.5毫升离心管加入30微升染色工作液，混匀小心加上上述含有染色工作液的溶液到切片样品上，覆盖样品表面放进37℃细胞培养箱里孵育60分钟，避免光照小心移去切片上的染色工作液小心加上500微升新鲜的清理液（ReagentA）小心移去清理液（ReagentA）小心加上500微升新鲜的清理液（ReagentA）放进37℃细胞培养箱里孵育30分钟小心移去清理液（ReagentA）盖上盖玻片即刻在（共聚焦）荧光显微镜下进行观察：激发波长340至400nm，散发波长510nm（组织细胞浆钙离子呈现蓝色荧光）注意事项本产品为20次（显微镜）或60次（酶标板）操作操作时，须戴手套可以使用荧光分光光度仪检测如果细胞内酯酶缺失，则建议使用微注射（microinjection）技术避免使用EDTA等处理样品孵育反应完成后即刻进行荧光测定如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度检测敏感度可达纳摩尔级钙浓度范围本公司提供系列钙生化检测试剂产品质量标准本产品经鉴定性能稳定本产品经鉴定检测敏感
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