病毒实验室检测植物病毒的方法

植物病毒是一类重要病害，几乎在各类作物上都有发生，严重影响农作物的产量和质量，用一般的方法难以防治，是生产上的一大难题。因而如何对种子、苗木等无性繁殖材料进行快速检测诊断显得尤为重要。本文主要介绍病毒实验室检测植物病毒的方法。

目前植物病毒检测主要是血清学检测(以病毒外壳蛋白为基础)和核酸检测，前者主要包括ELISA、快速免疫滤纸测定、免疫胶体金技术、免疫毛细管区带电泳、免疫PCR 等;后者主要有PCR、分子信标、实时RT-PCR和核酸杂交等。

血清学检测方法

酶联免疫吸附测定

酶联免疫吸附测定是一种采用固相(主要为聚苯乙烯酶联板)吸附，将免疫反应和酶的高效催化反应有机结合的方法，其基本原理是以酶催化的颜色反应指示抗原抗体的结合。目前该方法已被广泛用于植物病毒检测。在此基础上加以改进又发展了一些新的检测方法，如A蛋白酶联吸附(SPA-ELISA)、斑点免疫吸附(DIBA)、直接组织斑免疫测定( IDDTB) 、伏安酶联免疫分析、快速ELISA 等。

快速免疫滤纸测定法

快速免疫滤纸测定类似乳胶凝集反应，其原理是把待测病毒的抗体吸附在乳胶颗粒上，通过大颗粒乳胶间接反应小颗粒病毒的存在。所不同的是RIPA使用了一种红色乳胶，从而使检测更加简单和直观。RIPA目测检测提纯TMV 的灵敏度分别可达5ng/ml～50ng/ml。

免疫胶体金技术

免疫胶体金技术最早起源于电镜方面的研究，由于金在生物学上是惰性的，且有良好的电荷分布，可以和蛋白质(如抗体、A蛋白等)紧密结合，因此广泛应用于生物学和微生物学的各个领域。

免疫毛细管区带电泳

毛细管区带电泳是在装有一种电解液的空毛细管两端加一个外加电压。在外加电压作用下，通过电泳迁移和电渗流的作用，样品中的不同组分由于迁移率的不同而分开。免疫毛细管区带电泳将血清学反应专化性和毛细管区带电泳灵敏、快速、可自动检测的特点结合起来，实时检测抗原- 抗体复合体Eun等应用I-CZE检测到10fg建兰花叶病毒和齿兰环班病毒的提纯病毒。

免疫PCR 

近年来出现的免疫PCR是一种将抗原抗体反应的高特异性与PCR 的高灵敏度有机结合的检测技术，与酶联检测技术相比，免疫PCR是先用抗体来捕获抗原，提取核酸后，再用PCR 扩增DNA 片段，从而放大抗原抗体反应，大大提高了检测灵敏度。Sharman建立的复合免疫PCR ，可同时检测香蕉和车前草粗提液中的香蕉苞叶花叶病毒、黄瓜花叶病毒和香蕉束顶病毒。

以病毒核酸为基础的检测方法

多聚酶链式反应(PCR)

用PCR 检测植物病毒所需时间短，灵敏度特别高。用RT2PCR 检测苹果褪绿叶斑病毒和苹果茎沟病毒的灵敏度可达5pg。近年来，在此基础上又发展了多种方法用于植物病毒检测。 

分子信标(Molecular beacon) 

分子信标是具有茎环结构的一段单链核酸分子，5′- 端和3′- 端序列互补形成“茎”，与目标序列互补的探针序列为“环”，在5′- 端连接荧光组分，3′- 端连接猝灭组分。

TaqMan实时定量PCR

TaqMan实时定量PCR是将RT-PCR和荧光检测相结合，利用TaqDNA聚合酶的5′-端核酸酶活性来切割在扩增过程中与目标序列退火的荧光探针。探针5′- 端连接荧光组分，3′- 端连接猝灭组分，当探针完整时，无荧光出现。

核酸杂交技术

核酸杂交是先将待测核酸固定在膜上，然后用核酸探针与其进行杂交，使杂交体带上标记而被显示出来。一般采用核酸点杂交法来检测植物病毒，直接把病毒核酸点到NC 膜上再使之与探针杂交;也有的直接把病毒样品点到NC膜上。检测的专化性程度取决于探针与病毒核酸序列的互补程度。核酸杂交技术适用于DNA病毒、RNA 病毒及类病毒的检测，灵敏度高、特异性强，可检测到1pg的DNA。