使用超速离心机进行G

天美（中国）科学仪器有限公司

使用himacCP-NX超速离心机及P40ST水平转头

      G-蛋白偶联受体（GPCRs）主要位于细胞膜，并接收多种不同的信息，如光，味道，神经递质，及其它外部信号，并且这些信号通过G-蛋白转到细胞内。众所周知，GPCRs及相关蛋白与多种疾病密切相关，并作为被研究目标在新药开发中起到关键作用。GPCRs也在历史上两次诺贝尔奖（1994年的生理/医学奖及2012年的化学奖）中吸引了相当的关注。GPCRs是目前最吸引全球关注的蛋白之一。

      本文将介绍从脂质筏分离G-蛋白的离心方法。由于脂质筏可抵抗表面活性剂，我们将脂质筏溶在表面活性剂中，并通过使用蔗糖梯度液等密度梯度离心进行分离纯化G-蛋白。通过脂类的不同密度将该类蛋白与膜的其它部分分开并纯化。

详细步骤：

1.原始样品：鼠小脑颗粒细胞培养液

2.样品准备：将鼠小脑颗粒细胞混悬于2ml含有1%Triton X-100的TNE缓冲液

中，匀浆该混悬液，再加等量的含80%蔗糖液的2mlTNE缓冲液，混匀。

3.离心设备：

主机及转头及辅助设备：

himac超速离心机CP-NX及水平转头P40ST,并可选择使用himac的DGF-U密度制备仪进行梯度液自动制备

           CP100NX                                          P40ST转头                     DGF-U密度制备仪

◆himac超速离心机：

√最高转速100000rpm

√最大RCF803000xg

√实时运行曲线及记录

√远程监控和诊断

√驱动系统十年保用

√转头寿命自动管理

√用户管理和密码锁控制

√符合GMP要求

◆DGF-U密度梯度制备仪：

可在不同的离心管内自动制作梯度液，而且离心分离后样品及梯度液可自动连续取出，并可通过连接到带连续流动池的紫外分光光度计及馏分器，实现自动检测及收集

4.离心条件：

P40ST水平转头（40000rpm,13mlx 6）

离心管：13PA管

转速：40000rpm（RCF：284000xg）

离心时间：17小时

温度：4℃

加减速速率：8加/8减

样品量：4ml

密度梯度液：6ml5-30%蔗糖的连续密度梯度液

5.操作过程：

将4ml样品加到13PA管底部，然后将6ml含有TNE缓冲液的5-30%蔗糖梯度液加到样品层上。再将P40ST转头放置到CP100NX上，在40000rpm（200000xg）下离心17小时。离心结束后，按每

1ml从上到下分步收集梯度液，并分别放置在标注好的第1-10管内。含有G-蛋白的脂筏层DRM

（抗detergent的脂膜）将在第3-5管，而非脂筏层将在第7-10管。详见下图示例：

6.所用试剂：

TNE缓冲液（25mMTris-HCL，150mMNaCl，1mMEGTA，pH7.5）

TNE缓冲液+1%Triton X-100

80%蔗糖在TNE缓冲液内

30%蔗糖在TNE缓冲液内

5%蔗糖在TNE缓冲液内

（来源：天美（中国）科学仪器有限公司）