凝胶电泳

凝胶电泳也称胶体电泳，用于分离不同物理性质。主要分为琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。凝胶电泳通常用于分离分析，也可以作为制备技术，在采用某些方法（如质谱(MS)、聚合酶链式反应(PCR)、克隆技术、DNA测序或者免疫印迹）检测之前部分提纯分子。

当一种分子被放置在电场当中时，它们就会以一定的速度移向适当的电极，这种电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳的迁移率。它同电场的强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比。也就是说，电场强度越大、电泳分子所携带的净电荷数量越多，其迁移的速度也就越快，反之则较慢。

由于在电泳中使用了一种无反应活性的稳定的支持介质，如琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺胶等，从而降低了对流运动，故电泳的迁移率又是同分子的摩擦系数成反比的。已知摩擦系数是分子的大小、极性及介质粘度的函数，因此根据分子大小的不同、构成或形状的差异，以及所带的净电荷的多少，便可以通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离开来。

在生理条件下，核酸分子的糖-磷酸骨架中的磷酸基团呈离子状态，从这种意义上讲，DNA和RNA多核苷酸链可叫做多聚阴离子(Polyanions)。因此，当核酸分子被放置在电场中时，它们就会向正电极的方向迁移。由于糖-磷酸骨架结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因而它们能以同样的速度向正电极方向迁移。在一定的电场强度下，DNA分子的这种迁移速度，亦即电泳的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型，分子量较小的DNA分子比分子量较大的DNA分子迁移要快些。

凝胶电泳种类有：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、二维凝胶电泳、变性凝胶电泳、脉冲电场凝胶电泳等

琼脂糖凝胶电泳是用琼脂或琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。对于分子量较大的样品，如大分子核酸、病毒等，一般可采用孔径较大的琼脂糖凝胶进行电泳分离。其分析原理与其他支持物电泳最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。

琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。但由于其孔径相比于蛋白质太大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中。

聚丙烯酰胺凝胶电泳技术是指聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺(简称Acr)和交联剂N，N 一亚甲基双丙烯酰胺(简称Bis)在催化剂过硫酸铵(APS)，N，N，N ，N 四甲基乙二胺(TEMED)作用下，聚合交联形成的具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。

聚丙烯酰胺凝胶电泳技术可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条区带，如果分离纯化的样品中只含有同一种蛋白质，蛋白质样品电泳后，就应只分离出一条区带。SDS是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物。

二维凝胶电泳即双向凝胶电泳，是由两向电泳组成，第一向是以蛋白质电荷差异为基础进行分离的等电聚焦凝胶电泳，第二向是以蛋白质分子量差异为基础的SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳。它是蛋白质组研究中最有效的分离技术。

双向凝胶电泳技术最先是由O’Farrell于1975年所描述，其原理是在相互垂直的两个方向上，分别基于蛋白质不同的等电点和分子量，运用等电聚焦电泳和SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳把复杂的蛋白质成分分离和展现在二维平面上。

其中等电聚焦凝胶电泳是依据蛋白质分子的净电荷或等电点进行分离的技术。

变性凝胶电泳是在凝胶中加入了尿素或甲酰胺等碱 性试剂制作的凝胶称作变性凝胶，DNA样品在变性凝胶中的电泳分离过程称作变性凝胶电泳。变性凝胶电泳是在凝胶中加入了尿素或甲酰胺等碱性试剂制作的凝胶称作变性凝胶，DNA样品在变性凝胶中的电泳分离过程称作变性凝胶电泳。在正常情况下，DNA分子是以双链形式存在，在普通凝胶中，DNA分子由于核苷酸序列排列的内部特征，岈能具有不同的空间构型，使得M分子产生不同的迁移率，出现诸如“影子带”等异常谱带，影响结果的判定。

在脉冲电场中，DNA分子的迁移方向随着电场方向的周期性变化而不断改变。在标准的PFGE中，第一个脉冲的电场方向在另一侧成45°夹角。由于琼脂糖凝胶的电场方向、电流大小及作用时间都在交替变化，使得DNA分子能够随时调整其游动方向，以适应凝胶孔隙的无规则变化。与相对分子质量较小的DNA相比，相对分子质量较大的DNA需要更多的脉冲次数来更换其构型和方位，使其按新的方向游动。应用脉冲电场凝胶电泳技术，可成功分离到高达107bp的DNA大分子。

1、用 1× TAE 电泳缓冲液制作琼脂糖凝胶，加 1× TAE 电泳缓冲液至液面覆盖凝胶。

2、在超净工作台上，用移液器吸取总 RNA 样品 4μl 于封口膜上。在实验台上再加入 5μl 1×TAE 电泳缓冲液 及 1μl 的 10X 载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔。

3、打开电源开关，调节电压至 100V，使 RNA 由负极向正极电泳，约 30min 后将凝胶放入 EB 染液中染色 5min,用清水稍微漂洗。在紫外透射检测仪上观察 RNA 电泳结果。 

4、切胶时尽可能切掉不含DNA片段的凝胶；

5、注意DNA酶污染的仪器可能会降解DNA，造成条带信号弱、模糊甚至缺失的现象。 

6、要尽量减少DNA在紫外下的照射时间以减少对DNA的损伤；