凝胶层析的原理

凝胶层析又称分子筛过滤、排阻层析等。凝胶层析是利用凝胶分子筛对大小、形状不同的分子进行层析分离。凝胶层析具有设备简单、操作方便、分离迅速及不影响分子生物学活性等优点。目前已被广泛应用于各种生化产品的分离和纯化。

凝胶层析法适用于分离和提纯蛋白质、酶、多肽、激素、多糖、核酸类等物质。分子大小彼此相差25%的样品，只要通过单一凝胶床就可以完全将它们分开。利用凝胶的分子筛特性，可对这些物质的溶液进行脱盐、浓缩、去热源和脱色。

凝胶是一类多孔性高分子聚合物，每个颗粒犹如一个筛子。当样品溶液通过凝胶柱时，相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔而只能沿着凝胶颗粒间的孔隙，随着溶剂流动，因此流程较短，向前移动速度快而首先流出层析柱。

反之，相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔，可自由地进出凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，它们从凝胶内扩散到胶粒孔隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入与逸出，使流量增长，移动速率慢而最后流出层析柱。

而中等大小的分子，它们也能在凝胶颗粒内外分布，部分进入颗粒，从而在大分子物质与小分子物质之间被洗脱。这样，经过层析柱，使混合物中的各物质按其分子大小不同而被分离。

Vt=Vo+Vi+Vg

Vt=πR2h

Vo简称为外水体积，Vo等于被完全排阻的大分子的洗脱体积。可以用一个已知相对分子质量远超过凝胶排阻极限的有色分子，如常用的蓝色葡聚糖-2000溶液通过柱床，即可测出柱床的外水体积Vo。

Vi简称内水体积，可由g·Wr求得(g为干凝胶质量，单位为g，Wr为凝胶吸水量，以mL/g表示)。Vi也可以从洗脱一种完全不受凝胶微孔排阻的小分子溶质(如重铬酸钾)的洗脱体积Ve计算，即

Ve=Vo+Vi

对某物质在凝胶柱内洗脱体积Ve、Vo和Vi之间的关系可用下式表示：

Ve=Vo+Kd×Vi

式中Ve为脱体积，它包括自加入样品时算起，到组分最大浓度出现时所流出的体积。Kd为每个溶质分子在流动相和固定相之间的一个特定的分配系数，它只与被分离物质分子大小和凝胶颗粒内孔隙大小分布有关。Kd可通过实验由Ve、Vo和Vi求得。

Ve=Vo+Kd×Vi

可改写为：

Kd=(Ve-Vo)/Vi

当Kd=0时，Ve=Vo，说明这种溶质相对分子质量大，完全不能进入凝胶颗粒微孔内，被排阻于凝胶颗粒之外而最先洗脱下来;当Kd=1时，即Ve小分子=Vo+KdVi，说明这种溶质的相对分子质量小，完全向凝胶颗粒内扩散，在洗脱过程中将最后流出柱外。

但实际上，约有1/5的内水因溶剂化作用而呈水合状态，妨碍小分子的自由扩散。故实际上Ve小分子=Vo+0.8Vi;当0 Kd 1时，意味着溶质分子只有部分向凝胶颗粒内扩散，Kd愈大，进入凝胶颗粒内的程度愈大;Kd=0.5时，其洗脱体积Ve=Vo+0.5Vi。

1、凝胶层析操作简便，所需设备简单。有时只要有一根层析柱便可进行工作。分离介质—凝胶完全不需要像离子交换剂那样复杂的再生过程便可重复使用。

2、分离效果较好，重复性高。最突出的是样品回收率高，接近100%。

3、分离条件缓和。凝胶骨架亲水，分离过程又不涉及化学键的变化，所以对分离物的活性没有不良影响。

4、应用广泛。适用于各种生化物质，如肽类、激素、蛋白质、多糖、核酸的分离纯化、脱盐、浓缩以及分析测定等。分离的分子量范围也很宽，如Sephadex G类为102～105d;Sepharose类为105～108d。

5、分辨率不高，分离操作较慢。由于凝胶层析是以物质分子量的不同作为分离依据的，分子量的差异仅表现在流速的差异上，所以分离时流速必须严格把握。因而分离操作一般较慢。而且对于分子量相差不多的物质难以达到很好的分离。此外，凝胶层析要求样品粘度不宜太高。凝胶颗粒有时还有非特异吸附现象。

1、凝胶层析技术用于脱盐

高分子(如蛋白质、核酸、多糖等)溶液中的低分子量杂质，可以用凝胶层析法除去，这一操作称为脱盐。本法脱盐操作简便、快速、蛋白质和酶类等在脱盐过程中不易变性。

适用的凝胶为SephadexG-10、15、25或Bio-Gel-p-2、4、6。柱长与直径之比为5-15，样品体积可达柱床体积的25%-30%，为了防止蛋白质脱盐后溶解度降低会形成沉淀吸附于柱上，一般用醋酸铵等挥发性盐类缓冲液使层析柱平衡，然后加入样品，再用同样缓冲液洗脱，收集的洗脱液用冷冻干燥法除去挥发性盐类。

2、凝胶层析技术用于分离提纯

凝胶层析法已广泛用于酶、蛋白质、氨基酸、多糖、激素、生物碱等物质的分离提纯。凝胶对热原有较强的吸附力，可用来去除无离子水中的致热原制备注射用水。

3、凝胶层析技术测定高分子物质的分子量

用一系列已知分子量的标准品放入同一凝胶柱内，在同一条件下层析，记录每一种成分(已知分子量的标准品)的洗脱体积，并以洗脱体积对分子量的对数作图，在一定分子量范围内可得一直线，即分子量的标准曲线。测定未知物质的分子量时，可将此样品加在测定了标准曲线的凝胶柱内洗脱后，根据物质的洗脱体积，在标准曲线上查出它的分子量。

4、凝胶层析技术高分子溶液的浓缩

通常将SephadexG-25或50干胶投入到稀的高分子溶液中，这时水分和低分子量的物质就会进入凝胶粒子内部的孔隙中，而高分子物质则排阻在凝胶颗粒之外，再经离心或过滤，将溶胀的凝胶分离出去，就得到了浓缩的高分子溶液。