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蛋白质印迹优点、原理和步骤
免疫印迹（immunoblotting）又叫做蛋白质印迹（Western blotting），是通过抗原抗体的特异性结合来对复杂样品中的某种蛋白进行检测的方法。...[查看全部]
免疫印迹法实验原理和目的 ： 免疫印迹法临床应用免疫印迹主要试剂免疫印迹分类和原理免疫印迹法操作步骤免疫印迹法原理、试剂准备和注意事项
免疫印迹（immunoblotting）又叫做蛋白质印迹（Western blotting），是通过抗原抗体的特异性结合来对复杂样品中的某种蛋白进行检测的方法。此方法是一种新的免疫生化技术。
免疫印迹法 (Western blotting) 是一种结合了免疫化学分析和技术高分辨率凝胶电泳的杂交技术。免疫印迹法是对蛋白质特性、表达与分布进行检测最常用的一种方法，例如病毒的抗体或抗原检测、多肽分子的质量测定与组织抗原的定性定量检测。免疫印迹法具有很强的特异性，很高的敏感度以及很大的分析容量。免疫印迹法(immunoblotting test,IBT)也叫做酶联免疫电转移印斑法(enzyme linked immunoelectrotransfer blot,EITB),由于其类似于Southern早先建立的检测核酸的印迹方法 Southern blot ，因此也被叫做Western-blot。
电转移方法
一般需要利用电泳方法将经电泳分离后的蛋白转移到固相载体上，这个过程被叫做电泳印迹。以下为常用的两种电转移方法。
1.半干法:
用缓冲溶液浸湿的滤纸将凝胶和固相载体夹在中间，通电10-30min。
2.湿法：
在转移缓冲溶液中浸放凝胶和固相载体夹心，由45min延长到过夜为转移时间。
因为湿法有更大的使用弹性而且没有对更多的时间和原料产生明显地浪费，所以这里仅对湿法的基本操作过程进行描述。
需要采用可以识别一抗的第二抗体来识别目的蛋白，往往将购买的成品，即是如辣根过氧化物酶般已经被结合或标记了特定的试剂作为抗体。利用辣根过氧化物酶所催化的一个比色反应，即是这种标记，该反应的产物在固相载体上固定以及有特定的颜色，鉴别非常容易。所以能够根据识别二抗来对一抗进行识别，从而使目标蛋白所在的位置被判断出来。碱性磷酸酶系统和125I标记系统均属于其他的识别系统。
实验原理
蛋白质印迹法又叫做免疫印迹法，这是一种
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免疫印迹法就是将蛋白质往膜上转移，之后利用抗体进行检测。能够使用相应抗体作为一抗对已知表达蛋白进行检测，能够通过融合部分的抗体对新基因的表达产物进行检测。
操作步骤
一、获取蛋白质样品：
细菌诱导表达后，能够通过电泳上样缓冲液将细胞直接裂解，将匀浆缓冲液加在真核细胞上，机械或超声波室温匀浆0.5-1分钟。之后4摄氏度下13,000g离心15分钟，取上清液作为样品。
二、电泳：
对电泳凝胶进行制备，进行SDS-PAGE。
三转移：（半干式转移）
1、完成电泳后将胶条切成合适大小，使用转膜缓冲液平衡，分别进行3次，每次5分钟。
2、膜处理：将与胶条同样大小的滤纸和NC膜预先裁好，将其在转膜缓冲液中浸没10分钟。
3、转膜：转膜装置按照从下至上的顺序依次将阳极碳板、24层滤纸、NC膜、凝胶、24层滤纸、阴极碳板放好，精确对齐滤纸、凝胶、NC膜，每一步均将气泡去除，将500g重物压上，吸干碳板上多余的液体。将电源接通，恒流1mA/cm2，转移1.5hr。完成转移后，将电源断开，取出膜，对待测膜条割取来做免疫印迹。在膜染色液中放入有蛋白标准的条带染色50秒之后，在50%甲醇中多次脱色，至背景清晰，然后用双蒸水洗，风干，保存在两层滤纸之间，和显色结果对比。
四免疫反应：
1、洗膜使用0.01M PBS进行清洗，每次5分钟，一共3次。
2.将包被液加入加入，室温下保持2小时。
3.将包被液弃掉，洗膜使用0.01M PBS进行清洗，每次5分钟，一共3次。
4.将一抗加入（用0.01M PBS根据合适稀释比例进行稀释，膜必须全部为液体所覆盖），在4摄氏度下放置超过12小时，阴性对照，一抗使用1%BSA替代，其余步骤和实验组一样。
5.将1%BSA和一抗弃掉。膜使用0.01M PBS分别进行清洗，每次5分钟，一共4次。
6、将辣根过氧化物酶偶联的二抗加入（用0.01M PBS根据合适稀释比例进行稀释），平稳摇动，室温下保持两
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免疫印迹（immunoblotting）又叫做蛋白质印迹（Western blotting），是通过抗原抗体的特异性结合来对复杂样品中的某种蛋白进行检测的方法。此方法是一种新的免疫生化技术，其是基于凝胶电泳和固相免疫测定技术发展出来的。如今免疫印迹已经成为蛋白分析的一种常规技术，因为其既具备固相免疫测定的高特异性和敏感性，又具备SDS-PAGE 的高分辨力。某种蛋白的鉴定一般使用免疫印迹，并且可以定性和半定量分析蛋白。和化学发光相结合进行检测，能够同时对多个样品同种蛋白的表达量差异进行比较。
优点
免疫印迹法是一项对抗原、抗体进行分析的技术。其具备如下优点。
1.孵育、洗涤的时间减短非常明显。
2.为了用于多种分析和鉴定，能够同时制作多个拷贝。
3.以图谱形式显示结果，能够长期保存结果。
4.免疫探针能够利用将PH值降低等方法抹掉探针，用第二探针替换来进行进行分析检测。
5.湿的固定化基质膜柔韧，操作简单便捷。
6.固定化的生物大分子能够均一地接近各种免疫探针，孔径不会对其起阻隔作用。
7.免疫印迹分析所需的试剂量较少。
基本原理
在凝胶板上单向或双向电泳分离混合抗原样品，之后取固定化基质膜与凝胶相贴。凝胶中的单一抗原组在印迹纸的自然吸附力、电场力或其它外力作用下往印迹纸上转移并且固相化，最后应用如免疫同位素探针或免疫酶探针等免疫覆盖液技术检测和分析抗原固定化基质膜。
基本步骤
抗原分离、抗原印迹和抗原检定为免疫印迹法（ 以抗原分析为例）的三个基本步骤。因为每一步采用不同的实验方法，能够使多种免疫印迹分析系统构成。
免疫印迹法临床应用 ： 蛋白质印迹优点、原理和步骤免疫印迹法三个阶段免疫印迹法原理、试剂准备和注意事项免疫印迹法操作步骤免疫印迹法实验原理和目的
免疫印迹法是往膜上转移蛋白质，然后利用抗体进行检测。可通过融合部分的抗体对新基因的表达产物进行检测，可用相应抗体作为一抗对已知表达蛋白进行检测。其有很强的特异性，很高的敏感度，以及很大的分析容量。在对于蛋白质特性、表达与分布的检测方面最为常用。例如病毒的抗体或抗原检测、多肽分子的质量测定以及组织抗原的定性定量检测。
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临床意义
需要检查人群：检查某种蛋白。异常结果：有特殊显色反应，证明有某种蛋白质存在。
注意事项
不适宜人群：无
检查时禁忌：无
1、不同的蛋白要经过预实验来确定一抗、二抗的稀释度、作用时间和温度的最佳条件。
2、使用时必须新鲜配置显色液，最后将H2O2加入。
3、DAB有潜在可能致癌，要小心仔细地操作。
免疫印迹法原理、试剂准备和注意事项 ： 免疫印迹法临床应用免疫印迹主要试剂免疫印迹分类和原理免疫印迹法实验原理和目的免疫印迹法操作步骤
免疫印迹法就是将蛋白质往膜上转移，之后利用抗体进行检测。能够使用相应抗体作为一抗对已知表达蛋白进行检测，能够通过融合部分的抗体对新基因的表达产物进行检测。
原理
Western Blot类似于Southern或Northern杂交方法，然而其采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，用标记的二抗来“显色”，抗体为“探针”，蛋白质为被检测物。经过PAGE分离的蛋白质样品往固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上转移，固相载体以非共价键形式来进行蛋白质的吸附，并且可以使其生物学活性和电泳分离的多肽类型保持不变。抗原使用固相载体上的蛋白质或多，和对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过放射自显影或者底物显色来对电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分进行检测。该技术也在蛋白水平的表达的检测方面得到广泛地应用。
试剂准备
1、0.01M PBS(pH7.4）：
Na2HPO4 1.44g；
KH2PO4 0.24g；
NaCl 8.0g；
KCl 0.2g；
加ddH2O至1000ml。
2、膜染色液：
乙酸2ml；
ddH2O118 ml；
包被液（5%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1.0g 溶于20ml的0.01M PBS中。
考马斯亮兰 0.2g；
甲醇80ml。
3、显色液：
硫酸镍胺 0.1ml；
H202 1.0μl；
DAB 6.0mg；
0.01M PBS 10.0ml。
4、SDS-PAGE试剂：见电泳实验。
5、匀浆缓冲液：
10%SDS 6.0ml；
1.0M Tris-HCl(pH 6.8)；
1.OmlddH2O 2.8ml；
β-巯基乙醇 0.2ml。
6、转膜缓冲液：
SDS 0.37g；
甲醇200ml；
甘氨酸 2.9g；
Tris 5.8g；
加ddH2O定容至1000ml。
注意事项
1、DAB有潜在可能致癌，要小心仔细地操作。
2、使用时必须新鲜配置显色液，最后将H2O2加入。
3、不同的蛋白要经过预实验来确定一抗、二
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Western免疫印迹（WesternBlot）是往膜上转移蛋白质，然后利用抗体进行检测。可通过融合部分的抗体对新基因的表达产物进行检测。可用相应抗体作为一抗对已知表达蛋白进行检测。
主要试剂
1、5%(w/v)脱脂奶粉。
2、在磷酸缓冲盐溶液(PBS)中溶解NaN30.02%叠氮钠(有毒，戴手套操作)。
3、Tris缓冲盐溶液(TBS):
NaCl 500mmol/L，Tris/HCL(pH7.5)20mmol/L。
4、Tween20(15)鼠抗人-MMP-9(16)鼠抗人-TIMP-1。
5、过氧化物酶标记的第二抗体。
6、NBT(溶于70%二甲基甲酰胺，75mg/ml)。
7、BCIP(溶于100%二甲基甲酰胺，50mg/ml)。
8、Tris-HCL(pH9.5)100mmol/L。
9、NaCl100mmol/L。
10、EDTA5mmol/L，Tris-HCL(pH7.5)50mmol/L。
11、丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺：
含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液的配制应当使用温热（对溶解双丙稀酰胺有利）的去离子水。取1gN，N-亚甲叉双丙稀酰胺，29g丙稀酰胺，将水加入到100毫升。将其在棕色瓶中，4℃避光保存。由于碱催化或者光催化会发生脱氨基反应，因此必须确保PH不高于7.0。如果出现沉淀，可以过滤，若使用期超过两个月，就必须重新配制。
12.十二烷基硫酸钠SDS溶液:
10%(w/v)0.1gSDS使用1mlH2O去离子水配制，在室温下保存。
13、分离胶缓冲液:
48ml 1mol/LHCL和1.5mmol/L Tris-HCL(pH8.8): 18.15g Tris混合，加水稀释，使终体积到100ml，过滤后在40摄氏度下保存。
14、浓缩胶缓冲液:
在40ml H2O中溶解0.5mmol/L Tris-HCL(pH6.8):6.05g Tri
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