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NADP

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放大字体  缩小字体    发布日期:2019-08-27  来源:仪器信息网  作者:Mr liao  浏览次数:351
分光光度法 50 管/48 样
正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定测定意义:
MDH (EC 1.1.1.37)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,线粒体中 MDH 是 TCA 循环的关键酶之一,催化苹果酸形成草酰乙酸;相反,胞浆中 MDH 催化草酰乙酸形成苹果酸。草酰乙酸是重要的中间产物, 连接多条重要的代谢途径。因此,MDH 在细胞多种生理活动中扮演着重要的角色,包括线粒体的能量代谢、 苹果酸-天冬氨酸穿梭系统、活性氧代谢和抗病性等。根据不同的辅酶特异性,MDH 分为NAD- 依赖的 MDH 和NADP-依赖的 MDH, NADP-MDH 主要存在于真核细胞中。
测定原理:
NADP-MDH 催化 NADPH 还原草酰乙酸生成苹果酸,导致 340nm 处光吸收下降。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1 mL 石英比色皿和蒸馏水。
试剂的组成和配制:
试剂一、提取液 60 mL 1 瓶,在 4℃保存; 试剂二、液体 50 mL 1 瓶,在 4℃保存;
试剂三、粉剂 2 支,-20℃保存;临用前加入 300 L 蒸馏水;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
试剂四、粉剂 2 支,-20℃保存;临用前加入 300 L 蒸馏水;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
样本测定的准备:
1、细菌、细胞或组织样品的制备:
细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104 个):试剂一体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 试剂一),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);8000g 4℃离心 10min,取上清置冰上待测。
组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 试剂一),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
2、血清(浆)样品:直接检测。
测定步骤:
1、 分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 340nm,蒸馏水调零。
2、 将试剂二在 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)水浴 10min 以上。
3、操作表:
将上述试剂按顺序加入 1 mL 石英比色皿中,混匀后立即在 340 nm 波长下记录初始吸光度 A1 和反应 1min
后的吸光度 A2,计算 A=A1-A2。
注意:若 A1-A2 大于 0.5,需将样本用提取液稀释,使 A1-A2 小于 0.5,可提高检测灵敏度。计算公式中乘以相应稀释倍数。
 
 
 
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