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如果样品中含有离子化化合物，对于反相HPLC（RP-HPLC）分离，流动相pH值可作为控制保留的最重要的变量之一。
然而，如果控制不当，pH值也可能诱发诸多问题。
由于经RP-HPLC分析的大多数化合物含有一个或多个酸性或碱性官能团，因此大多数流动相需要控制pH值。
基于此，缓冲液的使用非常广泛。本手册为实际操作的色谱分析人员重点介绍了流动相pH值的一些重要方面。
为什么要控制PH值？
图1表明，如果存在离子化化合物，则需要控制pH值。
如果酸性溶剂pKa上下浮动超过2个pH单位，则至少99％的部分将分别离子化或非离子化。
低于其pKa时，碱基将被离子化；而超过其pKa时，将被非离子化。
非离子化形式将具有较小的极性（更疏水），因此在反相体系中能够更加有效地保留下来。
所以，pH值较低时，会保留更多的酸性（图1a），而在高pH值下，会保留更多的碱性（图1b）。
为什么要控制PH值？
如果流动相pH值接近pKa值，那么即便pH的变化极为微小，也会导致保留情况的巨大变化，因此，这不适合稳定分离。
图2a说明了部分化合物对pH的微小变化极为敏感。0.1个pH单位的变化就会导致分辨率两倍的变化，这是许多实验室常见的pH调节误差量。
图2b显示了酸性、碱性和中性化合物pH值与保留情况的关系。
pH为3时，其保留情况比pH为5时更加敏感（对于酸性），而对于碱性，则pH需要大于等于6。而且，当pH接近pKa时，保留时间将不稳定；如果存在类似结构的化合物，相应的峰值间距（选择性）会发生改变。
图2 流动相pH值的微小变化对分离的影响。
（a）碱性分析物：对氨基苯甲醚、间甲苯胺、对氯苯胺、间氨基苯甲腈（按保留次序）；27:73甲醇/磷酸盐缓冲液。
（b）酸性（酸）：水杨酸；碱；甲基苯丙胺；中性；非那西丁。
在选择流动相pH时还应考虑的另一个因素是色谱柱的稳定性。
一般来说，硅基色谱柱应在2
pH大于8时，硅胶骨架可溶性变强。较高纯度的硅胶比较低纯度的产品更耐受较高的pH值。
另一个较为复杂的问题是，硅胶颗粒表面上可能会电离出未键合的硅醇（-Si-OH）基团。
对于较老的、纯度低的硅胶（通常称为 A型 硅胶），这些硅醇基团的pKa在pH4-5的范围内。也就是说，在pH 6时，这些材料会发生显着的硅烷醇电离。
为什么要控制PH值？
一直以来这都是通过阳离子交换过程使碱性化合物达到峰拖尾的主要原因。
较新的高纯度（ B型 ）硅胶的pKa 7，因此由离子化硅烷醇位点的阳离子交换引起的峰拖尾是最小的。
因此，高纯度硅胶比较老的硅胶的峰形更好，正如图3所示分离中的几种碱基成分那样。
除了峰形得到改善之外，由于这些不可预测的次级硅烷醇相互作用的减少，高纯度硅胶比低纯度硅胶具有更好的再现性。
图3. 高纯度硅胶在减少碱基硅烷醇拖尾的效果。
成分：去甲麻黄碱、去甲替林、甲苯（中性）、丙咪嗪、阿米替林。
条件：250 x 4.6 mm, 5 m
色谱柱；80:20甲醇/25 mM 磷酸盐(pH 6.0)；1.00mL/min
