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肺癌发病率和死亡率
2017年2月4日，国家癌症中心公布的最新数字显示，在中国恶性肿瘤发病率为270.59/10万，死亡率为163.83/10万，其中肺癌为发病率、死亡率双率第一，每年约59.1万人死于肺癌，其中男性居多，约40.2万。
同样在美国，2017年1月5日，美国癌症协会的统计表明，如下表所示，在美国男性和女性中肺癌的致死率依然是位居第一［1］。
图1. 美国癌症发病率和死亡率
肺癌细胞的分类
根据肺癌的分化程度和形态特征，目前肺癌主要分为两大类，即非小细胞肺癌和小细胞肺癌，前者主要包括腺癌、鳞状细胞癌、大细胞癌［2］。
常见的肺癌模型
肺癌模型主要分为CDTX肺癌细胞移植模型（皮下移植模型和原位移植模型），PDTX（人源肿瘤组织异种移植模型）和基因修饰的肺癌模型，下面依次介绍。
一、CDTX肺癌细胞移植模型肺癌模型中，根据接种部位主要分为皮下和原位移植模型，在这类模型中需要选择正确的肺癌细胞株，可以参考上表中肺癌细胞分类，并根据实验目的选择正确的荷瘤模型，如皮下荷瘤主要用于单独研究肿瘤生长情况。
1. 皮下荷瘤
定义：根据研究的肺癌类型及基因突变情况，选取状态好的肿瘤细胞移植于小鼠皮下。例如，我们研究KRAS突变的肺癌，通常选取KRAS突变的A549细胞，细胞量为1x106－3x106/只。具体的操作视频和分组请参考往期内容（3.8 移植性肿瘤模型的建立之皮下荷瘤），此处不再赘述。
2. 原位荷瘤
定义：将肿瘤细胞通过注射等方式移植到模式动物肺部构建的动物模型。
模型优点：与皮下荷瘤模型相比，能更好反映肿瘤在人体内的一个发生发展及转移过程。
实验操作方法：
为了便于观察肺癌细胞在体内生长情况，选用带荧光素酶（Luciferase）标签的A549细胞，取对数生长期的A549-Luc（106/只）用胰酶消化收集，1 PBS洗两次，用PBS重悬后与生长因子减少的Matrigel基质胶按1:1的比例混合，每只老鼠注射100 l含1 106个细胞的混合悬液；
选取6-8周龄的Balb/c无胸腺裸鼠，置于超净工作台中麻醉，裸鼠由兴奋状态转为麻醉状态后将其以右侧卧位固定，胸腔表面用酒精消毒。
确定位置：位于小鼠左侧肋弓下缘以上约1cm处（第四、五肋弓之间），这一部位有两条纵向较粗的血管，肺部位于这两条血管之间（视频中用黑色marker笔标注位置）；
露出肺部：先将表皮剪一约5mm的小口，沿此小口逐步剪开下层皮下及肌肉组织，隔着胸膜可以看到粉色的肺部，肺部会随着小鼠的呼吸收缩和扩张。
取混匀的100 l的细胞悬液，沿着切口对准小鼠的左肺缓慢注射，进针深度约为3mm，注射结束后停针5s，左右旋转慢速出针。
将剪开的小鼠表皮进行缝合，将小鼠以右侧卧位（使伤口朝上）置于37℃恒温加热板上直至小鼠苏醒，放回原笼中继续饲养，4-6天伤口即可愈合。
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注意事项：
1. 为什么使用Matrigel？
如果肿瘤细胞仅用PBS重悬便注射到小鼠肺部，细胞可能随肺部气管快速扩散，造成气管堵塞导致小鼠死亡，使用Matrigel与细胞混合后进行实验便可降低小鼠死亡风险。
2. 如何避免出血？
操作过程中要避开较粗的血管，以免流血影响后续实验操作以及肺部的观察；并且最好选用胰岛素注射器，由于注射器针头扎入肺部有可能损伤肺部大血管，很容易造成小鼠的死亡，因此注射器最好选用针头较细的胰岛素注射器。
3. 注意整个操作过程及手术器械要保持无菌，以免小鼠感染［3］。
后续分组和试验分析
分组时间：一般原位注射一周后，裸鼠肺癌原位模型建成，进行分组（n=10）；
如何分组：依据裸鼠体重腹腔注射相应剂量的D-luciferin (Xenogen) 荧光底物（150 mg/kg），将裸鼠放置于麻醉箱中通以2.5%异氟烷/氧，待裸鼠麻醉后转入IVIS厢室中，使其腹面朝下并持续通以麻醉气体，注射底物10min后，进行荧光成像，测量各裸鼠肺部初始荧光值，依据荧光值的大小平均分组。随后可进行给药等实验，定期进行荧光检测。
人道终点：动物伦理学规定，小鼠肿瘤重量不可超过小鼠体重10%，平均肿瘤直径不超过20mm，并且如果出现溃烂，并且严重转移，造成感染或坏死时，应该中止实验且对动物施行安乐死。
图2. 肺部原位注射的荧光图和肺部白光图[4]
二、PDTX（人源肿瘤组织异种移植模型）定义：将病人肺癌组织移植到小鼠皮下等部位，主要用于抑制肿瘤生长（细胞增殖）的药物的筛选检测，在近年该模型越来越受重视。
模型优点：因为取自病人的肿瘤组织，在组织形态和遗传特征等方面均与人类肿瘤相同，故这种模型可以更贴近人类肿瘤的生物学特性。
实验操作方法：
1）处理新鲜肺癌组织：在无菌条件下的冰上对新鲜离体的肺癌肿瘤组织，剔除包膜及坏死组织，切成约15mm3（2mm 2mm 3mm）的小块；
2）首次接种小鼠：将切好的组织碎片用镊子填入定制的套管针尖端内，注射到5-6周NOD/SCID重症联合免疫缺陷小鼠背部皮下，每只老鼠背部可以接种1-2个位点，每例肿瘤接种2-3只小鼠，此接种过程须在肿瘤标本离体后2h之内完成，为提高成瘤率肿瘤块也可混合10% Matrigel进行荷瘤；
3）再次传代：当裸鼠皮下肿瘤生长至1000 mm3左右，表示移植成功，对其处于对数增长期的原代（F1代）皮下移植小鼠模型进行传代。
另一部分组织按照上述接种步骤，移植到4-5只裸鼠皮下，建立第二代移植小鼠模型（F2代）；
按照此流程，在裸鼠体内连续传代3代后，移植瘤的生长速度开始稳定，可进行体内动物模型实验。
不同处理组的肺癌的PDTX模型［4］
三、基因修饰模型定义：主要是利用基因编辑技术如CRISPR/Cas9进行敲除或插入特定基因，从而诱发动物产生肿瘤的模型。肺癌基因修饰模型主要是KRAS突变诱导肺癌等产生，KRAS突变同时P53缺失会加速肿瘤的发生发展。
模型优点：主要用于肿瘤发生发展过程及作用机制的研究；同时原癌基因的频发突变是肿瘤产生的重要原因之一，因此靶向这部分原癌基因的抗肿瘤药物筛选是一个重要方向。
构建方法：可以参考我们往期基因编辑小鼠构建过程（包括KO,KI,CKO小鼠的构建等）
举例：Lox-STOP-Lox-KrasG12D Conditional Mouse Model
Ras在人类肿瘤频发突变，K-ras的激活突变是肺部肿瘤产生的原因之一。在k-ras locus上敲入了Lox-Stop-Lox-KrasG12D，通过小鼠鼻腔注入Ad-Cre重组腺病毒，诱导肺中的K-rasG12D表达，从而诱发肺癌［5］。
应用：由于其产生的机制及组织形态和遗传特征等方面均与人类K-ras突变肿瘤相似，因此该模型能够很好的评价针对K-ras突变的抗肿瘤药物活性［4］。
准确的肺癌动物模型至关重要，它是获得正确实验数据和发表文章的重要前提，本期我们根据多年的经验，为大家总结了3种常见的肺癌模型。随后，我们会继续介绍其他肿瘤模型的构建，所以做其他肿瘤方向的童鞋不要着急，后期内容会越来越精彩。如果您觉得我们的内容还不错，快快点击上方蓝字关注吧！
参考文献
［1］Siegel RL, Miller KD, Jemal A. Cancer Statistics, 2017. CA Cancer J Clin. 2017 Jan;67(1):7-30.
［2］Lung Carcinoma: Tumors of the Lungs. Merck Manual Professional Edition, online edition. [2007-08-15].
［3］Wang YW, Wang XW, Wei JM, et al. Establishment of NSCLC in situ metas- tasis model using GFP/A549 cells. J Shandong Univer (Health Sciences), 2006, 44(7): 698-702.
［4］Wang J, Hu K, Guo J, et al. Suppression of KRas-mutant cancer through the combined inhibition of KRAS with PLK1 and ROCK[J]. Nature Communications,2016: 11363-11363.
［5］Michel DuPage, Alison L Dooley Tyler Jack. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase .Nat Protoc. 2009;4(7):1064-72.
