猪甲状腺细胞培养的实验注意事项——中国生物器材网

一、实验步骤
1. 杀猪后迅速取出甲状腺 1～2 个，置于盛有 75%酒精的烧杯中，用冰盒送至实验室(1 h 以内)。
 
2. 立即置于pH为7.4 的PBS缓冲液(含青链霉素)中，反复漂洗，直至漂洗液清澈透明。
 
3. 去除包膜及结缔组织，用眼科剪子、镊子将甲状腺组织剪成1mm3 大小的碎块。
 
4. 置含0.25%胰酶和300 U/ml 胶原酶的容器中，放于 37℃温箱中消化60 min，每隔15min 需摇动一次。
 
5. 用吸管将上清液的三分之二吸入离心管中，并加入含有胎牛血清的培养基终止消化。
 
6. 以1000  rpm 离心10分钟后，弃上清。
 
7. 将细胞沉淀用F-12 培养基制成细胞悬液，充分吹打并用不锈钢网(200目)过滤，再以1000 rpm 离心10分钟，弃上清。
 
8. 沉淀悬于含15% 胎牛血清和1 U/L牛 TSH的F-12 培养基中，台盼蓝染色证明活细胞数大于95%，调整细胞浓度接种于培养板中(1 ml/孔)。
 
9. 置于 37℃的5% CO2 孵箱中，每 2-3 天换液一次，至细胞融合成片后用于实验。
 
二、结果
猪甲状腺细胞培养 24 小时，镜下细胞贴壁，呈聚集生长，细胞呈圆形或椭圆形。
 
注意事项
1. 原代培养时，接种的细胞活性的好坏直接关系到培养的成败。
 
2. 组织热缺血时间短的组织的细胞活性好。取材后尽量不要耽搁时间，宜尽快处理并培养。
 
3. 对于仅为单纯独立的甲状腺腺瘤而质地较软的组织，因相对容易消化，消化时间可以适当缩短。
 
4. 镜下观察接种到培养瓶中的原代细胞，若大部分为5～10个相连的细胞小团，就容易生长。