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图14中可清楚反映这一点
但是，对于HILIC分离则不同。通常，HILIC色谱柱的平衡时间比RPLC色谱柱的更长。
这是该技术的一个特点，也是可再现保留所必需的。
在固定相粒子周围建立和形成稳定的水合层对可再现HILIC色谱法很重要（HILIC色谱法的重现性至关重要）。
所花费的时间也因相位（固定相）特性、洗脱剂和分析物而各有不同，因此取决于具体应用。
下面的指导原则可用作近似法（近似的参考）。
重要的是：在HILIC方法开发中，平衡将作为各项分离的一个参数进行研究（对于每一个成熟的分离方法，在HILIC方法开发时，平衡时间都将作为一个参数进行研究）。
对于全新的未使用色谱柱，建议使用60-80倍柱体积，以在最初建立HILIC所需的水层。
图14
RPLC和HILIC模式中达到全新未使用色谱柱所需的柱体积数的对比
一旦建立水层，可实现可再现（重现性）和一致的保留和色谱法（可实现色谱方法的重现性，一致的保留时间）。
运行完成后，应清洗色谱柱并根据第9节中相关指导说明储藏。
对于色谱柱第二次以及之后的每次运行，建议只采用20倍柱体积，以达到稳定的保留次数（时间），见图15。
图15
HILIC模式中第二次及随后每次分析达到平衡所需的柱体积数对比
色谱柱：ACE 5 HILIC-A,
100 x 3.0 mm
流动相：10 mM甲酸铵，pH4.7（溶于MeCN/H2O中）（90:10 v/v）
流速：0.43 mL/min
温度：25 C
检测：UV, 214 nm
样本：
1) 2 -脱氧鸟苷
2) 4-羟基苯甲酸
3) 沙丁胺醇
梯度HILIC平衡
同时，ACE HILIC相也可以使用可再现梯度HILIC法（ACEHILIC色谱柱也可重现HILIC方法的梯度洗脱）。
经确定，两次进样之间大约需要10倍柱体积。两次进样之间的平衡时间低于新色谱柱所需的时间，因为只需要重新建立起始条件。
新色谱柱需要平衡，以在固定相颗粒上形成水合层（而新色谱柱需要长时间平衡，是因为需要在固定相颗粒上形成水合层）。
图16
显示了两次进样之间使用20倍柱体积平衡情况下，两次连续进样梯度HILIC分析的极佳保留再现性。
