基因检测实验室质评与分子实验室

　　基因检测作为一个新兴行业，在过去的两年里才兴起，特别是当基因检测项目越来越多地应用于医学临床时，临床分子诊断的质量问题也越来越突出，成为人们关注的焦点。目前，在临床应用中，同一实验室不同批次或不同实验室的同一标本检测结果存在差异，已成为困扰临床医生、患者和实验室技术人员的普遍问题。

　　国家对基因检测的监管也越来越严格。由于基因检测企业基本上是由生物学家创建的，而且大多数员工都是生物专业人士，因此在过去，他们可能更注重技术而不是质量。然而，随着基因检测实验室被纳入医学检测体系，越来越多的基因检测项目开展了全国性的质量评价活动。除了注重技术的发展外，基因检测企业也越来越重视实验室质量体系的建设。基因检测企业要想发展，必须同等重视技术和规范，才能有更多的发展机会。

　　2016年11月，国家卫生和计划生育委员会临床检查中心发布了2016年全国肿瘤游离DNA（ctDNA）基因突变检测室间质量评价调查结果报告。

　　PT实验室得100分(排名顺序不分先后)

　　实验室PT绩效总体统计分析

　　NGS满分率只有39.5%，合格率79%，所有方法满分的实验室占50%，合格率82%。从临床质量要求的角度来看，还有改进的需求和空间。如果同一患者的肿瘤基因检测结果不同，会使临床医生和患者对基因检测产生怀疑。因此，所有基因检测实验室都必须确立追求质量的目标。

　　分子诊断实验室建设与质量控制

　　Vol.1临床分子实验室的布局

　　临床分子实验室必须保证基因扩增检测的质量和生物安全，并满足国家对布局、设置、使用和管理的要求“临床基因诊断实验室管理暂行办法”；“临床基因诊断实验室工作标准”；“临床基因诊断实验室基本设定标准”及“生物微生物和生物医学实验室生物安全通用标准”临床基因诊断实验室的设置要求。

　　实验室设计的核心是避免污染，应具有简洁的外观、合理的结构布局、标准的风向设置和严格的防护措施。

　　设计包括试剂准备区、标本制备区、PCR扩张区、分析区四个独立实验区，各有缓冲区和三个系统(单向气流系统、单向物品传输系统和生物安全控制系统)。

　　1.1.结构布局设计

　　主体结构采用轻质砖墙（玻璃砖饰面）、钢化玻璃等材料分离，顶表面采用轻质材料，设有总缓冲走廊和试剂制备区，标本处理区，PCR扩展，分析区4个独立实验区。每个实验区都设有缓冲区，并配有储物柜和洗手盆，便于清洁和消毒。

　　(1)试剂配制区，这个区域是制备实验试剂的地方。PCR反应系统：常用30μl，50μl，根据实验者选择的成分的最终浓度和储备液的浓度，计算各成分的实际用量。

　　(2)标本处理区，在实验室接收和处理标本的地方，该区域的主要操作是保存临床标本和核酸（DNA，RNA）提取、纯化、储存和存储RNA逆转录操作。

　　(3)PCR扩增区，理论上说20~25个周期后，PCR产品的积累可以达到最大值。在实践中，由于每一步反应的产量不可能达到100%，所以无论模板浓度是多少，20~30次都是合理的循环次数。循环越多，特异性就越多。

　　(4)分析区，分析结果的地方，区域合并通过LIS分发报告功能。人员和物品进出每个实验操作区域都有自己的独立通道。实验操作区域之间的试剂和模板通过具有紫外线消毒功能的传输窗口进行单向传输。通过合理的结构和布局，实现了临床分子实验室的分区要求。每个实验操作区的天花板都有一个集中的通风系统，使每个操作区域的相对缓冲区形成相对负压，每个房间的气流通过集中的排气管单向流动。设置室间传输窗口，使样品模板和试剂单向流动。

　　1.2.实验室气流控制

　　为避免各试验区之间的交叉污染，应采用全送或全排气的形式，并严格控制排气比例，以确保各试验区的压力要求。实验室设计基于控制样品污染和生物安全保护的要求，在各实验操作区域设置全排气流控制系统。

　　该系统由吸顶排风机、专用排风管和屋顶风机组成。根据每个操作区域的面积，设置不同数量的排风机，力求每个区域的气压平衡。形成的气流方向为总缓冲走廊，空气流向每个缓冲区，每个缓冲区的空气流向每个实验操作区。

　　排气系统工作时，各实验作业区的气体通过排气扇和风道排出，相对于各缓冲区和总缓冲区处于负压状态，实现各区域气流的单向流动。

　　1.3.区域间物品的单向传输

　　试剂准备区和标本制备区PCR在扩展区和分析区之间放置带有紫外线灯的机械链析区之间，用于试剂、标本模板等的单向传动。

　　试剂制备区配置的试剂通过传输窗单向传输到单向传输PCR在扩展区，处理后的标本模板通过单向传输传输到PCR扩大区域，并在超净工作台上加样后进行扩增。

　　注意：PCR扩增区的任何项目都不会进入其他区域。

　　Vol.2临床分子实验室生物安全控制

　　2.1.二级生物安全柜

　　如果采用二级生物安全柜ThermoA2型，其内部清洁度可达100级。排气量为330CFM(流量单位，1CFM=28.3185L/min），其高效过滤器对0.3μM颗粒过滤率>99.999%，可有效防止气溶胶对标本的污染和对人员和环境的危害。

　　2.2.完善消毒系统和单向气流控制

　　(1)根据卫生部的规定，4个实验操作区和每个缓冲区“WS/T367医疗机构消毒技术规范”空气消毒的具体要求是安装紫外线灯、生物安全柜、超清洁平台和传动窗内的紫外线灯。在每个实验操作区域，还配备了一辆移动式紫外线消毒车和局部补充消毒。紫外线灯管应定期清其强度应每六个月检测一次。如果不符合标准，应立即更换。

　　(2)实现每个实验区域的相对负压状态和气流单向流动，确保每个实验区域的空气相互流动。

　　2.3.每个操作区域之间的货物和废物的单向传输

　　(1)试剂和标本通过各自的专用传输窗口单向传输到扩增区。每个实验操作区的人员都是固定的，操作服、鞋帽、口罩、手套、仪器设备、实验仪器分开配置，防止跨区域使用。

　　(2)各实验作业区的所有废弃物，包括剩余标本、废液、废弃耗材和反应物，均通过00.5%过氧乙酸溶液浸泡消毒后，由医院相关规定统一收集处理，经高压蒸汽灭菌后，确保环境安全。

　　建立全面的实验室质量管理体系：

　　质量管理体系是实验室质量政策目标、组织结构、设施环境、仪器设备、试剂耗材、人员权利和责任、操作程序、管理程序、质量保证、信息系统、文件控制、结果报告、咨询服务、投诉处理、纠正改进等要素的综合协调。质量体系的完善与分子病理实验室检测结果报告的可信度和满意度直接相关。因此，必须包括管理文件、程序文件和操作指导（SOP）包括质量体系文件，传达给所有相关人员，确保相关人员充分理解和执行本文件。更重要的是，我们应该控制日常测试过程的整个过程的质量，以确保测试结果的准确性和客观性。

　　(1)试验前的质量保证：

　　除了实验人员要熟悉SOP除符合质量要求的文件、环境设施和仪器试剂外，分子病理检测对象通常为核酸，样品的预处理包括采集.处理.保存是否得当尤为重要。如果手术标本离体，应及时取材并使用pH值为7.2～7.4%中性缓冲甲醛固定，固定液体的用量通常是标本体积的10倍。固定时间取决于标本的大小.一般为6-48h，避免因缺乏固定时间或时间过长而影响组织结构的完整性或破坏组织的抗原，从而导致组织的抗原FISH实验结果不理想，用于骨髓重排检测的淋巴瘤基因.必须使用血样EDTA抗凝，4℃保存；人乳头状瘤病毒（HPV）宫颈脱落细胞样本一经采集，应尽快送检。一般室温保存不超过12个h，4℃保存不超过7d，-20℃保存不超过3个月。又如RT-PCR实验室对样本的要求是，新组织必须尽快进行RNA酶处理或液氮冷冻储存，以防止RNA降解导致检测失败。检验前必须仔细核对检验申请表中填写的信息，收到样品后必须由收件人签字确认，确保其编号与送检样品编号一致。

　　(2)检验中的质量保证：

　　是否在国际或国家标准中发布.或者是权威技术组织指定的方法，或者是自己新设计开发的非标准方法.实验室应根据测试项目的原理，扩展和优化修改的标准方法.适用范围.检测灵敏度.准确性.检测方法的特异性和重复性确认。并通过与其它方法进行比较，获取客观数据，验证检测方法是否合适可行，检测结果是否准确可靠。例如，以指导靶向药物治疗为主要目的的肿瘤基因突变检测PCRSanger当直接测序法是实验室的检测方法时，它可以与具有相同检测目的的即时荧光定量PCR为了获得预期结果的一致性和检测极限等信息，方法进行了比较。另一个例子是，实验室引入了一套全自动原位杂交染色系统HER2.常规基因检测指导临床靶向药物治疗。对于相同的检测项目，与手动操作模式相比，无论是在设备中.试剂和操作程序发生了很大的变化。实验室作为建立新的检测平台，应制定相关的验证方法.根据相应的仪器操作程序和测试项目的标准操作程序.试剂质量.验证过程等HER2.基因检测结果的可比性，加强实验室的室内质量控制，使每个分子病理检测都有相应的标准操作程序，每个仪器设备的操作.维护.按照规定的程序进行校准。每次测试必须有质量控制对照，如阳性对照.阴对照等。此外，我们还应参与实验室之间的质量比较计划，即做好室间质量评估，这可以由卫生部病理质量控制评估中心等外部质量评估机构进行.计划组织的活动，如省市临床病理质量控制中心和临床检查中心，也可以与其他实验室交换样品。如果质量评价结果达不到控制标准，实验室管理层应及时参与纠正措施的实施。实验室应记录这些房间的质量评估结果.形成文件保存。

　　(3)试验后的质量保证：

　　在获得测试结果后，授权的分子病理学家将进行分析和审查，并公布结果。实验后剩余的样本，如DNA.为重复实验，可按规定保存白片等。不再用于检测的样品应按照实验室废物处理程序进行处理。

　　(4)发布结果报告：

　　分子病理学家应在规定的时间内以标准格式发布分子病理检测报告。如果测试结果未能及时获得，并可能影响患者的诊断或治疗，可以通过延迟报告通知医生，并及时采取纠正措施，尽快发布最终报告。测试项目的临床意义.评价原则.提交样本的注意事项.检测结果的适当解释应在医生或患者咨询时耐心沟通。定期收集临床部门对实验室日常工作和检测结果的建议和要求，并提出改进措施，确保每个工作过程都在质量控制范围内。

　　实验室除了满足临床检验中心的质量要求外，还应遵循ISO15189规范管理和运营，积极申请ISO15189认证：

　　1.什么是ISO15189

　　ISO15189是国际标准化组织的《医学实验室-质量和能力要求》（ISO）200布于2003年2月15日，分别于2007年.2012年12年进行，目前使用的版本为ISO15189：2012。

　　这个标准是基于ISO9000系列标准ISO/IEC17025:2005。ISO从文件名可以看出，15189强调了两个主题，即“质量和能力”。

　　质量是每个实验室生存的基础。质量保证的前提是建立一套完善的质量管理体系，并严格执行，而支持质量的唯一因素是能力，包括管理能力和技术能力。

　　目前，医学实验室正在我国进行ISO唯一被15189认可的权威机构是中国资格评定国家认可委员会（CNAS），现CNAS已将ISO15189:2012直译成中文，重新命名CNAS-CL02:2012《医学实验室质量和能力认可标准》。

　　2.目前中国有多少医学实验室通过ISO15189认可

　　截至2016年4月30日，中国已有209家医学实验室通过ISO15189认可，包括：167家医院实验室.医院核医学科.1医院病理科.2个血液中心和38个第三方独立实验室。国内通过。ISO上海是15189年最受认可的省份，共有34个；中国第一个通过ISO中国人民解放军总医院临床实验科是15189认可的实验室。

　　3.为什么医学实验室会想到ISO15189认可

　　1.提高医学实验室的质量和能力。医学实验室根据ISO15189的要求，质量管理体系的建设，结合PDCA循环思想，可以不断完善工作流程，提高工作效率。

　　2.提高人员素质。通过标准培训、人员考核和系统文件学习，可以大大提高实验室人员的服务意识和专业技能。让每个人都知道为什么要这样做，如何有意识地这样做，以及这样做的好处是什么。

　　3.增强社会知名度和市场竞争力。ISO由于15189是一个国际标准，它的批准也间接证明了实验室管理水平已经达到了国际标准，这进一步证明了医院的医疗质量非常高。因此，它将不可避免地吸引大量的患者到医院接受治疗，以提高医院的经济效益和市场竞争力。

　　4.避免医疗纠纷。基于实验室ISO15189要求建立一套完善.在标准化的质量体系中，实验者严格按照程序文件进行标准化操作，有效管理所有记录和实验数据。确保当患者提出问题或索赔时，有证据可依。

　　5.与国际接轨，促进国际贸易。通过与国际组织合作.区域组织或外国认证机构签署多边或双边互认协议，促进实验室检测结果的国际互认，从而促进对外贸易。

　　Vol.3 ISO建立15189质量体系的时间安排

　　准备阶段，时间1-2个月

　　1.决定：

　　要求实验室主任(管理层)ISO建立科室质量管理体系15189。

　　2.相关文件：

　　国家认可委网站下载相关文件，如：

　　CNAS-CL02:2012《医学实验室质量和能力认可标准》

　　CNAS-CL02:2012《医学实验室质量和能力认可标准》

　　CNAS-CL05:2009《实验室生物安全认可标准》

　　CNAS-CL43:2012《临床血液学检验领域应用说明》

　　CNAS-CL42:2012《临床微生物学检验领域应用说明》

　　CNAS-CL41:2012《体液试验领域应用说明》

　　CNAS-CL39:2012《临床免疫学定性检验领域应用说明》

　　CNAS-CL38:2012《临床化学检验领域应用说明》

　　CNAS-CL36:2012《分子诊断领域的应用说明》

　　CNAS-CL35:2012《实验室信息系统应用说明》

　　3.动员会：

　　实验室开展全体动员会议，宣传贯彻ISO建立了15189质量体系。

　　4.学习：

　　组织实验室全体员工学习ISO15189相关文件，更好地掌握文件相关内容。

　　5.文件准备及注意事项：

　　根据最新版文件的要求，实验室质量负责人安排相关人员编制部门文件，如：

　　①质量手册

　　②程序文件

　　③临床应用手册

　　④安全手册

　　5.1按现行2012版规定书写。

　　5.基于2012版的文件，并结合实验室自身的操作。

　　5.部门文件与标准文件规定的条款一致。

　　注：将批准标准转化为实验室的规定

　　6.文件审查：

　　文件完成后，组织相关人员检查和修改内容，确保质量手册.程序文件的符合性。

　　7.组织结构：

　　实验室主任.质量负责人.技术负责人.安全负责人.仪器管理员.试剂管理员.信息管理员.数据管理员、安全管理员等。

　　注：清晰的实验室组织结构图

　　初级实施阶段，时间2-3个月

　　1.专业组按有关规定使用第一批表格(部门级表格)按有关规定：

　　①温湿度记录

　　②冰箱(恒温箱)等记录

　　③标本交接记录

　　④不合格录不合格

　　⑤急诊标本登记和报告记录

　　⑥危急值报告记录

　　⑦仪器维修记录

　　⑧生物安全相关记录

　　……

　　2.用程序文件.CNAS-CL02:2012《医学实验室质量与能力认可标准》及各领域应用说明书编写专业组相关文件：

　　①专业组管理文件

　　②仪器SOP

　　③项目SOP

　　④性能验证

　　⑤各种表格的专业组

　　注意：SOP必须满足条款《ISO15189:2012。

　　3.进入第二批表格：

　　实验室相关表格及专业组表格。

　　4.内审：

　　组织部门内部审核人员和特邀人员（无证相关人员）对文件进行审核，确保程序文件与质量手册的一致性，对不符合项的文件进行整改，定文件。

　　5.报告项目：

　　ISO15189申报项目必须有以下要求。

　　①参加卫生部室间质量评价合格

　　②嗍源性

　　③性能验证

　　注意：报告项目不要一把抓，考虑第二年增加。

　　6.管理评审：

　　在下一阶段，通过管理理制度，进入下一阶段。

　　正式实施阶段为6个月

　　1.按规定出具文件，组织人员学习文件，并按表格规定填写。

　　2.根据各专业组领域的应用说明和部门文件规定，各专业组全面开展质量体系工作：

　　①室内质控

　　②室间质评

　　③性能评价

　　④人员比对

　　⑤仪器比对

　　……

　　注意:(原始数据全部保存)

　　3.管理仪器和试剂：

　　①仪器档案(三证).验收记录.仪器简历等)

　　②建立供应商清单

　　③实验室测量仪器验证

　　④评估合格的供应商

　　⑤实验室仪器一览表

　　⑥试剂验收

　　⑦试剂出入库

　　⑧试剂供应商一览表

　　……

　　4.人员培训：

　　严格按照《ISO15189:2012文件规定建立人员培训，需要培训计划.培训的实施.考试评估等。

　　注意:(原始数据全部保存)

　　5.期间进行内部审查(审查文件的有效性)，管理审查。

　　注意：(保留内部审查.原始数据管理评审)

　　6.自查：

　　严格按照《ISO自15189年申报中的审核表进行自查，整改，记录每一次自查结果。

　　上报.认可阶段

　　1.申报阶段(提交材料后3个月)

　　1.1填写阶段：

　　整理文件，在认可委网上下载“申请表”，严格按照表格填写，并填写报告项目:中间精度.重复精度.准确性等，填写必须与测量一致。注意：保留所有原始数据，未完成性能验证不考虑报告。

　　1.2认可委员会受理阶段：

　　认可委员会是否接受，文件审查是否接受，这一阶段需要3个月(系统完全一致)，认可委员会审核文件的符合性和全面性。如果出现问题，文件将被退回修改。

　　1.批准委员会通过后：

　　通知实验室派审查专家，此时实验室可以提出意见。

　　2.现场评审阶段

　　2.1认可委员会向专家组发送文件：

　　如果文件符合规定，专家组人员会阅读文件，同意现场评审。

　　2.2现场评审等级：

　　根据实验室提交的专业，相关评审专家一般为3-4天。第一次会议由专家组长主持。实验室主任花了10分钟报告质量体系。会议结束后，组长由实验室主任或质量负责人陪同，每个专业由专业组长陪同。

　　2.3现场试验：

　　一般来说，在审核前一周，专家组会联系实验室准备现场测试标本。根据实验室项目.仪器.人员建立比较方案，实验室人员按要求完成。

　　2.4现场评审期间的评估(抽问)：

　　授权签字人(必修).试剂管理员.资料管理员.仪器管理员等。

　　2.5现场检查后：

　　协助专家组填写实验室检查情况。

　　注:质量体系建立通过认可后，系统要坚持，形成标准化流程，一年后进行15189次监督评审，除数据填写不同外，其他流程相同。每两年审核一次，审核期间一般需要增加项目。

　　Tips：根据认可委员会的规定，申请材料存在以下任何一种情况，将被视为实验室存在诚信问题：

　　a.提供的申请材料自相矛盾，或与实际情况不符，如申请不具备的能力。

　　b.管理系统文件有明显的抄袭痕迹，如系统文件涉及到实验室不从事活动或不存在的部门。

　　c.不同的实验室提供相同的相关记录，或同一实验室提供的不同时间的质量记录(如内部审.管理评审记录)内容相似。

　　d.实验室质量记录.内容等方面有明显的造假痕迹。

　　e.对实验室申请材料的真实性还有其他疑问。