显微镜油浸物镜观察免疫荧光时用甘油来代替浸镜油

显微镜观察和照像

  特异性的荧光所发射的光线比起照明所需的总光度来说是较为
暗淡的。因此，由像汞弧高真空灯泡所发出的那种高强度光线对于
获得明亮的免疫荧光来说是一个最为起码的要求．

  虽然荧光素和绕丹宁强烈吸收300 nm以下的光线，但由于光学
系统很难将光线聚集在这一范围内而无法作为常规使用．对于这两
种荧光色索来说，第二个最大吸．收峰太接近于发射峰：在荧光显
微镜下观察是灵敏的，因为所发射的光线是在黑暗的背景中观察的
。为了这一目的，重要的是只能见到发射的荧光而不能见到照明的
光线。由于只有部分的照明光线被吸收，因而必须把未被吸收掉的
部分与发射的荧光分离开来．如果照明光线和发射的荧光的峰值很

接近，那么就无法将它们分开．因而，当用荧光素和绕丹宁进行免
疫荧光检查时常常使用近紫外区和短波蓝色的光线来作为照明光线
．在这样的波长范围内，荧光素和绕丹宁二者都吸收，尽管不像用
较短的或较长波长的光线时那样有效。在照明光线和样品之间所使
用的滤光片提供了这一波长范围并使得组织所产生的自身荧光减到
最小。

  次级滤光片放在样品和目镜之间以保留发出的荧光光线而截断
任何的激发光线。因此，次级滤光片应该能够将通过初级滤光片的
光线都阻断在使用双重染色技术时，需要将较弱的绕丹宁荧光与荧
光素的强荧光进行对比，

  因此最好是同时激发两个波长的光线而不只是一个，这样就能够
独立地改变对于荧光素最适合的激发光和对乎绕丹宁最适合的激发
光线的强度。

射出的荧光。然而，暗视野照明却大大简化了对于滤光片的选择，
因为即使不用滤光片也保证大部分的照明光线不能够达到目镜，而
只能看到荧光发射出来的光线。在实践中，暗视野聚光器通常是与
滤光片一同使用的。在油浸物镜下观察免疫荧光时用甘油来代替浸
镜油。

  照像是必需的，因标本在贮存过程中会褪掉荧光。荧光强度的
这种减弱对于照像技术本身也是一个重要的因素：在做暗视野显微镜
观察时总光线强度常很低，特别是当只有切片的一小部分发射荧
光时。因此，曝光时间就趋于很长。然而，在进行长时间曝光的过
程中，荧光强度本身亦逐渐消褪。故应尝试用最可能短的曝光时问
；因此，有人便推荐了具有高ASA等级的底片。除此之外，还需要
一个非常标准化的自动曝光表，因为光线的测量与曝光是同步的，
而在进行曝光期间荧光的任何减低都会自动地得到补偿．

  在进行照像的样品经过绕丹宁和FITC结合的抗体双重染色时，
重要的是要理解荧光素的荧光比绕丹宁荧光的寿命要短。在试图保
持FITC荧光方面，相当普遍的做法是在对组织进行细致的观察之前
先照下像来。当照像之后再观察组织时，大部分的染色可能已消失
，因面观测的结果不得不全然依靠暗视野照片．

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