利用电子显微镜和荧光显微镜观察细胞中蛋白质

利用电子显微镜和荧光显微镜观察细胞中蛋白质

采用生物化学、遗传学、细胞生物学、分子生物学和电子显微技术
对蛋白质定向、转位和转运的机制已进行了广泛研究。本章将涉及
用于蛋白质输出的研究技术。我们将这些技术分为四类：细胞内、
遗传学、细胞外和细胞生物学技术。当检验一种蛋白质在完整细胞
内的运动时，细胞内技术是必需的，并且常常使用遗传学方法来识
别突变体。遗传学技术是细胞内技术的分支，它在蛋白质转运研究
领域中起着最重要的作用。遗传学技术已揭示了许多在蛋白质输出
过程中转运复合体的蛋白质组分。细胞外技术也起到重要作用，它
用于确定被纯化蛋白质的功能，目的在于通过实验重现蛋白质转运
的过程。应用细胞生物学技术，已可利用电子显微镜和荧光显微镜
观察一个蛋白质在细胞中的运动。

  真核细胞细胞器和细胞膜的分离

  采用生物化学方法确定蛋白质在亚细胞器上的准确定位需要破
坏细胞形态，且需要将膜分离出来，因为真核细胞含有许多不同的
膜。这些膜包括质膜、内质网膜、核膜、高尔基复合体膜、过氧化
物酶体膜、溶酶体膜、线粒体膜，以及植物细胞中叶绿体膜和叶绿
体中的类囊体膜。已有证据表明膜定位是蛋白质共定位到其目标膜
上的过程。为了分离细胞器，首先要用尽可能温和的方法使细胞破
碎。内质网膜，又称微体，通常用Potter-Elvehjem匀浆机将狗的
胰腺匀浆，然后在低速离心下沉淀微体，再通过凝胶过滤柱进行过
滤。用各细胞器的标志酶来鉴定其分离纯度。
  细胞内研究·用药物和Sec突变体可揭示膜转位是否需要质子动
力势能以及Sec蛋白的作用。·蛋白酶与膜的接触以及信号肽加工
方面的研究为跨越细菌和内质网膜的蛋白质定位提供确定方法。·
天冬氨酸连接的寡糖修饰可用于跟踪在分泌途径中的糖蛋白定位。
·通过确定输出蛋白质是否与相应亚细胞组分一同被分离，可监测
该蛋白质是否
  定向到细胞器、细胞内膜结构或液态组分。

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