计量测序和小数点测序的贤光党争

定量PCR还是数字PCR?

随着数字PCR技术应用的展开，越来越多实验室被其绝对定量的方式、结果的高灵敏度、高重复性等特质所吸引。2012年年底，由Frost & Sullivan公司在北美市场进行的调研显示，约三分之一的被访者表示会考虑购买数字PCR设备。

　　那么，是否意味着目前在研究、临床和工业领域内，广泛采用的荧光定量PCR技术将被淘汰?数字PCR很快就要将其彻底取代?越来越多实验室类似问题。结合多年推广定量PCR与近几年投身数字PCR领域的经验心得，谈谈自己的体会，供大家参考。

　　总体的观点是：虽然绝大多数定量PCR的应用都可以使用数字PCR完成，但在可预期的将来，两者将长期共存。到底使用定量PCR还是数字PCR，取决于具体应用和对数据的要求。两者不是either/or的关系，而是both/and的关系。两种技术平台各自的特点与现状大致可从下面8个方面说明。

　　1. 在20多年的使用和发展中，定量PCR作为一种技术平台，已经产出海量的数据，在工业界和分子检测的某些应用上，定量PCR已经成为“金标准”。基础研究方面，则形成了被称为MIQE的“定量PCR标准实验指南”。

　　2. 在定量PCR的各种应用中，基因表达分析(gene expression analysis)的应用比重约占七成，综合各种因素来看，眼下定量PCR还是进行基因表达研究的理想手段。

　　3. 上述的“各种因素”具体展开，主要包括：通量、自动化程度、各种检测探针与染料、检测通道、成本和可参考文献与protocol的数目等等。

　　4. 就目前市场上已有的数字PCR设备来看，定量PCR在检测的线性范围上具有优势，意味着同一个run内可对各种表达丰度的样品进行分析。

　　5. 目前定量PCR已经能实现高通量样品条件下的自动化操作。

　　6. 数字PCR在单分子层面上的绝对定量，可以彻底摆脱对标准曲线的依赖而直接给出靶序列的拷贝数，提高了实验结果在批内和批间的稳定性，甚至能用来对标准品进行定标。

　　7. 基于绝对定量的方式，数字PCR结果的高重复性和高精度可实现微小差异的基因表达分析，如等位基因的不平衡表达、单细胞基因表达分析、microRNA表达分析等等。所谓“微小差异”的标准一般而言是指表达水平的差异在2倍以内。

　　8. 同等条件下，数字PCR在灵敏度方面拥有优势，使得该技术已成为肿瘤的液态活检、病原微生物检测、转基因成分测定、宿主残留DNA分析等的热门技术。

　　最后，我们来听听MIQE的作者之一：比利时Ghent University的Jo Vandesompele教授如何评价定量PCR和数字PCR之间的关系：

　　To those who say dPCR will replace the “very reliable” qPCR, he responds: “of course not.” Digital PCR, however, might be right for some applications such as detection of rare mutations or copy-number variants.

　　He believes that qPCR is the “technology of choice” for gene expression-based experiments, particularly measuring gene expression changes of more than twofold, which probably make up the majority of experiments. In those instances, “qPCR can do the job” and at a lower price point that dPCR, he says. But spotting gene expression differences among similar molecules such as splice variants or microRNAs might work better with dPCR.