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梯度优化在液相色谱方法开发中是非常重要的一个环节。有时，一个合适的梯度洗脱程序对液相色谱分析分离可起到 四两拨千斤 的作用。然而，许多小伙伴由于梯度优化实验做得相对较少，因此误认为梯度优化非常复杂。今天小编就带大家来揭开反相液相色谱梯度程序的神秘面纱，一探梯度优化的究竟。
一、建立梯度方法的原因
Q 为什么要用梯度的方式来洗脱呢？
当然，作为分析工作者，如果能以一个等度的条件完成我们的分离目的，那便是是皆大欢喜的，但实际情况常常不能如我们所愿。混合样品组分中，必定存在容易分离和不易分离的组分，保留较弱和保留较强的组分。
我们建立梯度洗脱程序的目的就在于，将容易分离的组分在洗脱能力较弱的流动相中实现尽快分离，而保留较强的组分在色谱柱内停留较长时间，与键合相表面发生充分的相互作用，尽可能地彼此拉开，最后用强洗脱能力的流动相洗脱出来，避免洗脱时间过长。
二、反相液相色谱体系流动相的洗脱能力
Q 前文既然讲到了流动相的洗脱能力，那么，反相色谱中，如何来判断流动相的洗脱能力呢？
我们可以来看一下下面这张图：
上图各位小伙伴应该都不陌生，所述的原理即是，在反相体系中，随着流动相的极性不断增加（水相的比例在不断增加），流动相整体的洗脱能力逐渐减弱，而保留时间则在逐渐延长。因此，前文中对于容易分离的组分，可尝试在流动相极性较大的环境下将其实现分离。
同时，为了提高整个样品混合组分的分离度，在整个梯度程序内，也尽可能使用高比例的水相作为梯度洗脱的起始条件。因此，对于很多小伙伴，在进行一个全新的项目的反相条件方法开发的时候，最chang用的初始梯度模式便是在0~40min内，进行一个95%水相 100%有机相的线性洗脱。
三、反相液相色谱梯度优化中心思路
反相色谱梯度优化的中心思路，其实就是尽可能减弱流动相的洗脱能力，从而减少共洗脱的情况。减弱流动相洗脱能力最y效的方式是更换洗脱强度弱一些的溶剂，或者增减流动相中的添加剂。
然而，很多情况下，小伙伴参照既定标准进行实验，溶剂种类和添加剂的量不便进行过多的调整，这样的情况下，还有一个方法可以调节流动相的洗脱强度，那就是减缓流动相的变化斜率。我们通过下面这个案例给大家说明：
通过上图我们可以看到，在梯度（一）条件下，多潘立酮和杂质D出现共洗脱，峰重叠。于是我们进行梯度程序的调节：
在梯度（二）中，10min时乙腈的比例为45%，而梯度（一）下10min时乙腈的比例为60%，并且梯度（二）中的后7min，乙腈的比例也并未继续升高至100%，这就使得梯度（二）条件中，每时每刻乙腈的比例都低于梯度（一），暨每时每刻流动相的洗脱强度都弱于梯度（一），如下图。如此一来，各杂质共洗脱的情况得到改善，结果就是如图3所示，8个物质都得到了分离。
四、注意事项
在进行方法开发梯度优化的时候，一定要注意兼容性的问题，包括流动相溶剂彼此之间的兼容性，以及流动相和样品的兼容性。
流动相溶剂选择上，最h是选择能够任意比例互溶的溶剂。若是流动相溶剂不方便更换，则需尽量减缓流动相的变化速率，给有机相和水相（盐相）更多的时间来互溶。
对于样品来说，流动相的性质一定要注意与样品溶剂能够兼容，避免出现在进样后的任意时刻样品不溶解、析出的情况。
