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在New Brunswick S41i CO2恒温摇床内采用透气袋实现人类T细胞快速扩增
Amanda Suttle、 Stacey Willard、 Ma Sha
美国康涅狄格州恩菲尔德艾本德公司 联系方式： sha.m@eppendorf.com
摘要
近年来细胞治疗领域取得的进步大大提升了对T细胞扩增技术的需求。 T细胞必须能够迅速扩增， 才能在维持高存活率和T细胞属性的同时达到高细胞密度。 搅拌罐生 物反应器是实现大规模扩增的最佳细胞培养工具之一。 然而， 在生物反应器内进行细胞培养需接种大量细胞。 我们开发出了利用透气袋为台式生物反应器接种生产 足量T细胞的方法。
我们利用放置在New Brunswick S41i CO2恒温摇床内的透气袋进行悬浮T细胞培养， 并测试了来自不同制造商的细胞培养袋， 最大灌注量从120 mL到5 L不等。 此外， 我们还测试了不同的振荡速度， 以确定T细胞扩增的最佳条件。 由于T细胞放置在固定平台上无法生长， 所以需要适当的振荡。 我们还探索了更传统的利用振荡摇瓶 进行悬浮培养的方法。 结果表明， 使用透气袋更为成功， 不到4天其扩增量就超过了10倍， 而在摇瓶中则只扩增了2 - 3倍。 综上所述， 我们利用透气袋和CO2恒温摇 床， 建立了一种在搅拌罐生物反应器内大规模制备培养T细胞的方法。
介绍
在过去的几年里， 许多研究和开发实验室一直在研究可以实现T细胞大量生长的条件， 以支持细胞治疗应用对高质量T细胞需求的增长。 一直以来， 血库实验室进行T 细胞培养的主要目标都是维持细胞群以便后续输注。 该技术尚无法满足研发和商业使用所需的水平。 利用生物反应器培养法扩增细胞是经过充分论证的， 但还没有 针对淋巴细胞进行充分地优化。 实际上， T细胞敏感而脆弱， 既往实验都证明很难为台式生物反应器接种生产足够的细胞。
其他的悬浮哺乳动物细胞， 包括诸如干细胞等敏感细胞， 可以如前所示， 利用CO2控制的恒温摇床成功在摇瓶中培养[1]。 然而， 鉴于我们利用摇瓶法对原代人类T细 胞进行培养的初步研究并未取得成功。 因此， 我们又开发出了在New Brunswick S41i CO2恒温摇床（艾本德， S41I1200100） 中通过振荡透气袋来培养这些T细胞的 新方法。 该方法显著优化了T细胞培养， 得到了能够为台式生物反应器接种生产出足量T细胞的快速有效的初始扩增条件。 例如， 在台式研究中， 我们采用了一台 BioBLU 3c一次性罐（艾本德， 1386000300） ,设置为最大工作容积(3.75 L)， 目标细胞接种密度为0.5 x 106 cells/mL， 则生物反应器接种总共需要1.88 x 108个细 胞。 该研究还建立了低温保存T细胞的方法， 这对此项研究至关重要。 通过建立低温保存库， 可将相同批次的细胞用于多个优化实验。
材料和方法
本研究采用一台New Brunswick S41i Co2恒温摇床进行T细胞扩增操作， 所用设备和试剂的完整列表见表1。
表1： 本研究所用设备、 耗材和试剂列表
培养基配方和恒温摇床设置
本研究的完全培养基配方包括Lonza的X- VIVO 10基础培养基（不含庆大霉素和酚红）， 还添加了5%热灭活人血清、 2 mM谷氨酰胺、 2 mM抗菌-抗真菌剂， 以及20 g/mL IL-2。
在所有研究中， S41i Co2恒温摇床都设置为5% CO2 水平。 将悬浮方瓶中生长的T细胞培养物放置在静置架上。 在Evolve袋中生长的T细胞培养物则放置在振荡平台 上， 并利用胶带将袋子各边粘在平台上将其固定（图1）。 固定住袋子后， 将摇床设置为默认的70 rpm振荡速度（除非另有说明）。 本研究的其余部分也采用该等设定 值和培养基配方。 如图1所示， S41i Co2恒温摇床可用于多种不同的T细胞培养方法。
图1： S41i恒温摇床能够同时支持摇瓶、 悬浮T-25方瓶和细胞培养袋进行T细胞培养
优化Evolve透气袋中的T细胞解冻和初始培养
我们对从STEMCELL Technologies购得的一瓶原代人外周血全T细胞采用了两 种不同的方法进行了解冻， 两种方法都使用了ThawSTAR CFT2自动解冻仪对瓶 装细胞进行解冻操作。 STEMCELL Technologies建议将T细胞解冻至T-25方瓶， 并静置两天。 使用5 mL最大灌注量的新鲜完全培养基。 T细胞培养的头两天遵循 该方案， 然后将细胞转移至Evolve袋中继续培养。 为了确定实现最佳细胞生长和 存活率是否有必要采取静置培养步骤， 我们评估了另一种方法， 即直接将瓶装细 胞解冻至120 mL的Evolve细胞培养袋中。 在研究的这部分中采用的是80 mL工作 容积的Evolve袋。 使用Vi-CELL Xr细胞存活率分析仪每天对两种方案进行取样和 计算， 以监测细胞的生长和存活率。此外， 还使用了Life Technologies的EVOS FL 细胞成像系统检查120 mL Evolve袋内的培养物。 图2显示的是以10X放大倍数拍 摄的人类外周血全T细胞。
图2： 使用Life Technologies的EVOS FL细胞成像系统在10X放大倍数下拍摄的Evolve 120 mL细胞培养袋内的T细胞生长情况
创建低温保存T细胞库和冷冻培养基配方
创建细胞库对本研究而言非常重要， 因为在进行广泛研究时， 购买多瓶原代人类 T细胞会使得成本过高。 一旦发现T细胞扩增的最佳条件， 便选择一包密度最高、 生存能力最强的Evolve袋复冻回细胞库中。 低温保存的培养基配方如表2所示。 首先，向已用培养基的细胞内再添加5%的热灭活人血清，将血清总浓度提升至 10%。然后，向该混合液内注入新鲜培养基。不得使用离心机对细胞进行标准回 冻等离心操作， 而是将DMSO直接添加到细胞和培养基的混合物中。 然后， 将其 分配到1 mL的低温保存管中。 随后， 将低温保存管放入BioCision CoolCell， 置 于温度设置为-80 C的New Brunswick Innova U360 ULT冰箱内过夜。 24小时后， 将其移入液态氮中进行长期保存。
优化Evolve透气袋的培养条件
解冻法得到优化后， 则针对理想的细胞生长和扩增能力对Evolve袋进行进一步评 估。 T细胞直接解冻至最大灌注量为120 mL的Evolve袋中， 工作容积为30 mL， 密度为0.5 x 106 cells/mL。 通过加入新鲜的完全培养基维持该密度水平， 直到工 作容积达到100 mL。 当袋子达到100 mL工作容积后， 根据需要， 可通过取出50 mL培养基， 替换成新鲜的完全培养基， 实现50%的容积置换， 以维持0.5 x 106 cells/mL的密度水平。
比较摇瓶和透气袋中的T细胞培养
此外， 本研究还使用了New Brunswick S41i Co2恒温摇床对不同振荡速度下带挡 板和不带挡板的一次性摇瓶培养和透气袋培养方案进行了比较。 每个摇瓶的接种 密度都为0.5 x 106 cells/mL， 利用了250 mL摇瓶20%的工作容积。 作为对照， 也采用上述标准最佳设定值和接种密度将T细胞放置在工作容积为100 mL的120 mL Evolve细胞培养袋中进行生长。
使用不同的透气袋评估扩大规模的可能性
当优化了120 mL Evolve袋T细胞培养后， 便开始尝试扩大规模， 首先从500 mL Evolve袋开始。 情况与上述情况一致。
我们还对另一制造商相似容积的透气袋的培养效果进行了研究。 除了大尺寸Evolve袋， 我们还使用了Lampire Biological Laboratories OMNI C3 250 mL细胞培养袋。 虽然Evolve袋的最大灌注量为500 mL， 我们只使用了200 mL工作容积， 以便将其与最大工作容积相对较小的Lampire袋进行比较。
结果与讨论
优化T细胞解冻方法和初始培养
我们对T细胞采取了两种解冻方法， 一种遵守了制造商建议的静置培养保持时间， 另一种则没有（见材料和方法）。 每天对两种培养基进行取样并监测细胞生长和存 活率。 过了初始解冻期后， 将其放入细胞培养袋中进一步培养， 细胞密度维持在0.5 106cells/mL水平， 并加入新鲜培养基以达到100 mL最大工作容积。 继续采用直 接解冻至袋中的方法。 相比悬浮方瓶静置解冻法， 该方法不仅更为方便， 峰值细胞密度也超过了前者。数据如图3所示。
图3： 静置解冻法与直接解冻至袋内比较（解冻后， 都采用为期8天的袋内培养）
建立T细胞低温保存库
许多制造商不保证低温保存后细胞能够存活。 然而， 我们已经通过自己的处理技术和培养基配方证明了可以将细胞保存起来， 以备将来使用（图4）。
图4： 将T细胞从低温保存细胞库取出解冻后， 在透气袋内培养生长， 并进行为期5天的监测
比较摇瓶和透气袋中的T细胞培养
摇瓶内培养的细胞生长密度并未达到同期透气袋培养的细胞密度水平。 如图5所示。 由于摇瓶和细胞培养袋的工作容积不同， 图5显示的是50 mL灌注量获得的细胞总 数， 以便进行比较。 在95和100 rpm的摇瓶培养中也观察到大量的细胞团。 在70 rpm摇瓶和透气袋培养中未观察到细胞团。 鉴于摇瓶培养表现不佳， 我们放弃了摇瓶 法， 将重点放在透气袋培养上， 并利用更大尺寸的透气袋进一步探索扩大规模的可能。
使用不同的透气袋评估扩大规模的可能性
为了确定Evolve袋是否是扩大生物反应器接种T细胞规模的理想方法， 本研究测试了另一制造商的细胞培养袋。 每天对每个袋子进行取样， 连续7天。 结果如图6所示， 200 mL工作容积的Lampire袋的密度大于较大尺寸的Evolve袋。 虽然峰值密度低于120 mL的Evolve袋， 但Lampire袋的总细胞数量比较大尺寸的Evolve袋高出了2.5 倍 （未显示数据）。 我们还测试了1 L到5 L的更大尺寸的透气袋， 但在最初的评估中未能成功实现T细胞扩增。
图5： 在塑料摇瓶中以不同振荡速度培养的T细胞相比透气袋培养的效果
图6： 比较较大尺寸的Evolve透气袋和Lampire透气袋在人类T细胞扩增方面的表现
结论
通过本研究， 成功地建立了细胞库以便进行进一步的实验。 在Evolve透气袋中， T细胞扩增明显。 采用120 mL Evolve透气袋时， New Brunswick S41i CO2恒温摇床 的振荡平台共可容纳10包Evolve袋。 如果10个Evolve袋的灌注量都为100 mL， 且密度均达到3.91 x 108个细胞/袋（图3）， 则1 L液体就可以达到3.91 x 109个T细胞存 活总量。在该密度条件下， BioBLU 3c一次性罐在3.75 L最大工作容积时，可接种大约255 mL的细胞数量。 利用S41i恒温摇床扩增的单批T细胞， 可实现1 L细胞接种 4台达到最大工作容积(3.75 L) 的BioBLU 3c一次性罐。
对Lampire透气袋的初步研究也显示了可以扩大规模的潜力。 Lampire袋的最大工作容积为250 mL。 本研究中， 其工作容积为200 mL。 S41i Co2恒温摇床2恒温摇床 的振荡平台最多可容纳6包Lampire袋， 可以将细胞总容量扩大至1.2 L。
本研究表明， 透气袋搭配S41i Co2恒温摇床可实现T细胞的快速初始扩增， 其能够产生足量的细胞接种多个台式生物反应器。
参考文献
[1] Khandaker Siddiquee和Ma Sha。 Microcarrier-based Expansion of Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells in Shake Flasks.Bioprocessing Journal, Volume 12, Issue 4, Winter 2013.
