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荧光定量PCR 实验步骤:
样品RNA的抽提
①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。
②两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。
③RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制)，清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。
⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。
⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40 l用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。
RNA质量检测
1)紫外吸收法测定
先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释(1:100)后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液 浓度和纯度。
① 浓度测定
A260下读值为1表示40 g RNA/ml。样品RNA浓度( g/ml)计算公式为:A260 稀释倍数 40 g/ml。具体计算如下:
RNA溶于40 l DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495 l的TE中，测得A260 = 0.21
RNA 浓度= 0.21 100 40 g/ml = 840 g/ml 或 0.84 g/ l
取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 l，剩余RNA总量为:
35 l 0.84 g/ l = 29.4 g
②纯度检测
RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。
2)变性琼脂糖凝胶电泳测定
①制胶
1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10 ml的10 MOPS电泳缓冲液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。
10 MOPS电泳缓冲液
浓度 成分
0.4M MOPS，pH 7.0
0.1M 乙酸钠
0.01M EDTA
灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25 l溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1 MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。
②准备RNA样品
取3 gRNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10 g/ml。加热至70℃孵育15分钟使样品变性。
③电泳
上样前凝胶须预电泳5min，随后将样品加入上样孔。5 6V/cm电压下2h，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2 3cm。
④紫外透射光下观察并拍照
28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓(其大小决定于用于抽提RNA的物种类型)，上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA(tRNA和5S核糖体RNA)组成。在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染，将会在28S核糖体RNA带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果
样品cDNA合成
①反应体系
序号
反应物
剂量
1
逆转录buffer
2 l
2
上游引物
0.2 l
3
下游引物
0.2 l
4
dNTP
0.1 l
5
逆转录酶MMLV
0.5 l
6
DEPC水
5 l
7
RNA模版
2 l
8
总体积
10 l
轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
②混合液在加入逆转录酶MMLV 之前先70℃干浴3分钟，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶0.5 l，37℃水浴60分钟。
③取出后立即95℃干浴3分钟，得到逆转录终溶液即为cDNA溶液，保存于-80℃待用。
样品
管家基因( -actin)实时定量PCR
① -actin阳性模板的标准梯度制备 阳性模板的浓度为10，反应前取3 l按10倍稀释(加水27 l并充分混匀)为10，依次稀释至10、10、10、10、10、10，以备用。
②反应体系如下:
标准品反应体系
序号
反应物
剂量
1
SYBR Green 1 染料
10 l
2
阳性模板上游引物F
0.5 l
3
阳性模板下游引物R
0.5 l
4
dNTP
0.5 l
5
Taq酶
1 l
6
阳性模板DNA
5 l
7
ddH2O
32.5 l
8
总体积
50 l
轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
管家基因反应体系:
序号
反应物
剂量
1
SYBR Green 1 染料
10 l
2
内参照上游引物F
0.5 l
3
内参照下游引物R
0.5 l
4
dNTP
0.5 l
5
Taq酶
1 l
6
待测样品cDNA
5 l
7
ddH2O
32.5 l
8
总体积
50 l
轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
③制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反应条件为:93℃2分钟，然后93℃ 1分钟，55℃ 2分钟，共40个循环。
模板
①针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应。
反应体系:
序号
反应物
剂量
1
10 PCR缓冲液
2.5 ul
2
MgCl2溶液
1.5 ul
3
上游引物F
0.5 ul
4
下游引物R
0.5 ul
5
dNTP混合液
3 ul
6
Taq聚合酶
1 ul
7
cDNA
1 ul
8
加水至总体积为
25ul
轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
35个PCR循环(94℃1分钟;55℃1分钟;72℃1分钟); 72℃延伸5分钟。
②PCR产物与 DNA Ladder在2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。
③将PCR产物进行10倍梯度稀释: 设定PCR产物浓度为1 10，依次稀释至10、10、10、10、10、10几个浓度梯度。
PCR
①所有cDNA样品分别配置实时定量 PCR反应体系。
体系配置如下:
序号
反应物
剂量
1
SYBR Green 1 染料
10 ul
2
上游引物
1ul
3
下游引物
1ul
4
dNTP
1ul
5
Taq聚合酶
2ul
6
待测样品cDNA
5ul
7
ddH2O
30ul
8
总体积
50 ul
轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
②将配制好的PCR反应溶液置于Realtime PCR仪上进行PCR扩增反应。反应条件为:93℃2分钟预变性，然后按93℃ 1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，共40个循环，最后72℃7分钟延伸。
