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摘要：本应用简报介绍了 mAb 产品中亚 ppm 宿主细胞蛋白质杂质的定量分析方法。本工作流程采用 Agilent AssayMAP Bravo 平台、Agilent 1290 Infinity II 液相色谱系统和 Agilent 6495C 三重四极杆 LC/MS 系统。
前言：宿主细胞蛋白 (HCP) 杂质是低浓度的蛋白质杂质，来源于生物药物生产过程中的宿主生物。由于它们可能影响产品安全性和功效，因此根据法规要求必须对药品中的 HCP 进行监测和控制[1]。传统上，酶联免疫吸附测定法 (ELISA) 是定量分析蛋白质治疗药物中 HCP 的标准方法。然而，ELISA 的特异性和覆盖率不足以鉴定并定量分析各种 HCP。因此，LC/MS 技术成为 HCP 分析的另一选择。在 HCP 的 LC/MS 定量分析过程中，主要挑战在于低丰度 HCP 肽段与高丰度药品肽段的共洗脱。因此需要在药品基质的高背景下对低丰度肽进行灵敏而可重现的定量分析。
本应用简报介绍了用于宿主细胞蛋白质高灵敏度定量分析的完整工作流程解决方案，
包括：
用于样品自动前处理的 Agilent AssayMAP Bravo 平台 用于样品分离的 Agilent 1290 Infinity II 液相色谱仪
用于数据采集的 Agilent 6495C 三重四极杆 LC/MS 系统
用于 MRM 方法开发的 Skyline 软件中的安捷伦自动化工具
使用 Agilent MassHunter 定量分析软件和 Skyline 软件进行数据处理使用基于多反应监测 (MRM) 的同位素稀释方法，结果显示可准确定量低至亚 ppm (ng/mg) 浓度的 HCP。
实验部分仪器 Agilent AssayMAP Bravo 系统 (G5571AA) Agilent 1290 Infinity II 液相色谱系统包括： Agilent 1290 Infinity II 高速泵 (G7120A) Agilent 1290 Infinity II Multisampler (G7167B)，配备样品冷却装置选件（选件 100） Agilent 1290 Infinity II 柱温箱 (G7116B) Agilent 6495C 三重四极杆 LC/MS 系统 安捷伦喷射流 ESI 离子源 (G1958-65138)
材料：人 IgG1 mAb（来自合作伙伴的一种研发产品）由中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞产生，并经过 Protein A 纯化。重型稳定同位素标记 (SIL) 肽标准品由第三方供应商定制合成（表 1）。所有 SIL 肽经 HPLC 纯化，质量通过 LC/MS 和氨基酸分析测定。
样品前处理使用 AssayMAP Bravo 系统进行 mAb 样品变性、还原、烷基化和胰蛋白酶解。将 SIL 肽以等摩尔浓度混合，并以 8 种不同浓度（每种 SIL 肽浓度为 6.25、 12.5、25、62.5、125、250、12500、 125000 amol/ g）加入样品酶解物中，用于定量分析。
LC/MS 分析：使用 9 分钟液相色谱梯度，通过 6495C 三重四极杆 LC/MS 在 dMRM 模式下分析样品。表 1 和表 2 详细列出了色谱和质谱分析的实验条件。使用与 Skyline 和 Agilent MassHunter 工作站软件集成的安捷伦自动化工具对 LC-dMRM 方法进行自动优化。
