《枯草微生物细菌红色var的鉴别 生态学检测法》建议募集

政策标准近日，为贯彻《中华人民共和国环境保护法》，保护生态环境，保障人体健康，提高生态环境管理水平，规范生态环境监测工作，生态环境部制定了《水质 灭菌指示微生物(枯草芽孢杆菌黑色变种)的鉴定 生物学检测法》。目前，标准编制单位已完成征求意见稿。按照《国家环境保护标准制修订工作管理规定》(国环规科技〔2017〕1号)要求，现面向全社会公开征求意见，请业内人士认真研究并提出书面意见，于2020年4月30日前通过信函或电子邮件的方式将意见反馈至生态环境部，逾期未反馈的按无意见处理。
 　　据了解，枯草芽孢杆菌黑色变种由美国的 Elizabeth 最先分离得到，因其在含酪氨酸的培养基上产棕黑色素而得名，其作为枯草芽孢杆菌亚种，本身不具有危害性，因能产生对热、紫外线、电离辐射和某些化学物质很强抗性的芽孢，可以作为消毒剂检测及灭菌质量控制方面的质量控制标准菌株进行应用。此外，枯草芽孢杆菌黑色变种也可作为炭疽杆菌的非致病性替代物，用于军事等方面研究；用于生产生物表面活性剂，在环境保护、有机物质处理和油回收等领域具有广阔的应用；用于芽孢形成、萌发、耐热机理等研究领域。因此，制定上述新标准对水环境卫生安全的监测和评价具有重要意义。
 　　《水质 灭菌指示微生物(枯草芽孢杆菌黑色变种)的鉴定 生物学检测法》规定了鉴定水中灭菌指示微生物的生物学检测方法，适用于经灭菌处置的废水中指示微生物(枯草芽孢杆菌黑色变种)的鉴定。标准的主要内容框架包括：适用范围、规范性引用文件、术语和定义、方法原理、干扰和消除、试剂和材料、仪器和设备、样品、分析步骤、结果与报告、特异性和稳定性、质量保证和质量控制、废物处理等。
 　　生物学检测法的方法原理为：灭菌处置后的废水通过孔径为0.45μm 的滤膜过滤，细菌和芽孢被截留在滤膜上，然后将滤膜置于酪氨酸选择性培养基上，37℃培养72 h～96h，枯草芽孢杆菌黑色变种产生的酪氨酸酶可分解利用酪氨酸形成黑色素，产生黑色的特征菌落。对特征菌落进行染色镜检和生化试验做进一步鉴定，枯草芽孢杆菌黑色变种为革兰氏阳性芽孢杆菌，营养细胞呈杆状，单个或呈短链状排列，芽孢椭圆形，中生，不膨大，能利用甘油、甘露糖，还原硝酸盐，水解淀粉，不能利用苦杏仁苷、甘露醇。根据结果报告检出或未检出枯草芽孢杆菌黑色变种。
 　　在检测过程中，需要的试剂和材料包括酪氨酸琼脂培养基、营养琼脂培养基、淀粉培养基、硝酸盐培养基、甘油复红肉汤培养基、甘露糖生化培养基、甘露醇生化培养基、苦杏仁苷生化培养基、革兰氏染色液、芽孢染色液、硫代硫酸钠、乙二胺四乙酸二钠、硫代硫酸钠溶液、无菌滤膜、无菌水等。实验用的仪器和设备包括采样瓶、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌器、pH 计、显微镜、分析天平、培养皿、过滤装置、移液管、三角瓶、酒精灯以及无菌室或超净工作台、生物安全柜等无菌操作设备。
 　　在样品采集方面，标准指出，如果采集的是含有活性氯的样品，需在采样瓶灭菌前加入硫代硫酸钠溶液，以除去活性氯对细菌的抑制作用(每125 ml 容积加入 0.1 ml 的硫代硫酸钠溶液)；如果采集的是重金属离子含量较高的样品，则在采样瓶灭菌前加入乙二胺四乙酸二钠溶液，以消除干扰(每125 ml容积加入0.3 ml 的乙二胺四乙酸二钠溶液)。在样品保存方面，标准明确，采样后应在2h内检测，否则，应10℃以下冷藏但不得超过6h。实验室接样后，不能立即开展检测的，将样品于4℃以下冷藏并在2h内检测。
 　　值得注意的是，在检测过程中，工作人员操作时应按要求佩戴防护器具，做好无菌防护；实验室操作需在无菌操作设备内进行，避免吸入呼吸道或接触皮肤和衣物。
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