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K599感受态细胞
K599 Chemically Competent Cell 产品说明书
产品规格 （CAT#: LM1080）
K599 Competent Cell： 100μl/支
pCAMBIA2301(control vector, 10ng/μl) 10μl
保存条件(保质期)： -80℃（12个月）
K599感受态细胞基因型
Agrobacterium rhizogenes (strR ) pRi2659 (agropine type)
K599感受态细胞产品说明
发根农杆菌是根瘤菌科(Rhizobiaceae)农杆菌属(agrobacterium)的一种革兰氏阴性土壤细菌，它能够感染大多数双子叶植物和少数单子叶植物以及个别裸子植物。K599发根农杆菌（NCPPB2659）含有pRi2659农杆碱型Ri质粒，具有广泛的宿主范围（葫芦科，豆科，茄科等），同时具有链霉素抗性。本公司生产的K599化学转化感受态细胞经特殊工艺制作，pCAMBIA2301质粒（卡那霉素抗性）检测，转化效率 103 cfu/μg DNA。
K599感受态细胞常规操作方法
1.取-80℃保存的K599发根农杆菌感受态于室温或手心片刻待其部分融化，处于冰水混合状态时插入冰中。
2. 每100μl感受态加入0.01-1 μg质粒DNA（转化效率较高，第一次使用前最好做预实验确定所加质粒的量），用手快速、剧烈拨打管底混匀或用枪吹吸混匀，依次放于冰中静置5分钟、液氮5分钟、37℃水浴5分钟、冰浴5分钟。
3. 冰浴中拿出放室温，加入700μl 无抗生素的TY液体培养基，于28℃振荡培养2小时。
4. 6000 rpm 离心一分钟收菌，留取 100 μl 左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含相应抗生素的 TY平板上，倒置放于28℃培养箱培养2-3 天
● 农杆菌相关抗生素配方：
抗生素
配方
原液
工作液
羧苄青霉素 (carb)
双蒸水溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌
50 mg/ml
50 μg/ml
硫酸卡那霉素 (kan)
双蒸水溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌
50 mg/ml
50 μg/ml
链霉素 (strep)
双蒸水溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌
10 mg/ml
50 μg/ml
利福平 (rif)
DMSO溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌
10 mg/ml
20 μg/ml
庆大霉素 (gent)
双蒸水溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌
20 mg/ml
40 μg/ml
氯霉素（cam）
无水乙醇溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌
34 mg/ml
34 ug/ml
常用农杆菌抗性： (R：抗；S：敏感。)
农杆菌菌株
羧苄青霉素(carb)
链霉素(strep)
利福平(rif)
氯霉素(gent)
硫酸卡那霉素(kan)
Ar.A4
S
S
S
S
R
MSU440
S
R
S
S
S
Ar.Qual
S
R
S
R
S
C58C1
S
R
R
S
S
ATCC15834
S
S
S
S
S
K599
S
R
S
S
S
Ar.1193
R
R
R
S
S
● TY配方（1L）：
Tryptone 5g
Yeast extract 3g
补水到1L体积，完全溶解后，121度、20分钟高温灭菌
配制1M的氯化钙水溶液，121度、20分钟高温灭菌
每1L 灭菌的TY液体营养液中加入10ml 无菌的1M氯化钙水溶液即可。
若配制TY固体培养基，则加入15g 琼脂粉。
注意事项
1. 加入质粒时体积不应大于感受态体积的1/10；质粒不纯或存在乙醇等有机物污染，转化效率急剧下降；质粒增大一倍，转化效率下降一个数量级。
2. 混匀质粒时应用手指快速拨打管底或用枪吹吸混匀，务必使质粒快速、均匀分散开，与感受态细胞充分接触。转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
3. 平板上阳性克隆密度过大时，由于营养不足，阳性克隆生长变慢，菌落变小，为了获得大的菌落，应减少质粒用量或降低涂板的菌量。
4. K599具有链霉素抗性，不可用于具有链霉素抗性质粒的转化。
同一批感受态细胞，用含目的片段的T载体质粒转化（阳性对照）能长出密密麻麻的菌落，而用另一种载体和目的片段的连接产物转化，却一个菌都没长出来，重复了三次都这样。请问这是感受态细胞的制作不过关，还是连接出了问题？哪个可能性大些？
答：应该是连接的问题。所有连接反应建议同时转化酶切后的质粒作为另一个阴性对照，确定酶切是否完全。同时连接前请确定质粒和片段浓度达到最小连接量的要求。
感受态细胞放到-80冰箱了有半年了，还能用来转化质粒吗？
答：如-80冰箱储存过程中没有发生冻融的情况，是可以用来转化的，但是由于冻存时间过长，转化效率会有所下降，如果用于普通的质粒重转或TA克隆等高效连接体系也是可以的，如珍贵的样品请选用较为新鲜的感受态细胞。
