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文章标题：M17细胞 细胞株培养
关键词：M17细胞培养，M17细胞价格，M17细胞来源背景，M17细胞，细胞株培养
中文名称：人神经母细胞瘤
生长状态：贴壁生长
1.试剂和溶液
1）转印缓冲液：0.025M Tris base , 0.187 M甘氨酸 , 25%甲醇
2）氨基黑溶液：0.1% 酸性黑10B
3）1 TBST：25mM Tris-HCl ( pH 8.0 ) , 0.2 M NaCl ,0.1%Tween 20
4）封闭液：TBST配制的5%牛奶
5）抗体稀释液：TBST配制的5%牛奶
6）显色系统：ECL显色
2.实验步骤
1电泳：将裂解液进行SDS-PAGE电泳，80v，30分钟，120v，90分钟；
2转膜：PVDF膜在甲醇中浸泡约30秒左右，滤纸浸泡在转印缓冲液预湿，半干法转印到PVDF膜上，10v，150分钟；
3染色：氨基黑染色5分钟，甲醇褪去背景色，观察条带；
4膜活化：将PVDF膜置于甲醇活化1min，用纯水洗膜2次后再用TBST洗涤3次；
5封闭：将膜条置于5%牛奶或2% BSA中，室温混摇2h；
6一抗孵育：将待检抗体用3%牛奶或2% BSA稀释到合适浓度（参照抗体说明书，根据客户预实验结果，稀释度上下浮动一个数量级都为正常），将膜放入对应的已稀释待检样品中，置4℃混摇孵育隔夜；
7洗涤：取出膜放在TBST中洗涤3 5min；
8二抗孵育：将膜取出放入稀释好的HRP标记的二抗（参照二抗说明书进行稀释）中，室温混摇2h；
9洗涤：取出膜放在TBST中洗涤3 5min；
10ECL显色：将膜取出放入混匀的ECL显色液中，孵育3min，将膜取出贴在有荧光角标的胶片上，迅速用保鲜膜包好；
11曝光：把底片放在暗盒中，根据荧光强度分别对X光胶片作不同时间段的曝光，曝光结束后，将底片取出，1min显影，30s清洗，1min定影，30s清洗，晾干；
12结果分析：用扫描仪将曝光后的X光胶片扫描，做后续结果分析。
选择适当的细胞接种浓度。一般情况下，96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行MTT试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止致细胞过满。这样，才能保证MTT结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。否则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异。
注意:细胞株的生物等级，由于有些细胞株及菌株属于管制品，所以从国外购货比较麻烦。
形态学改变:细胞体积明显增大,为成熟淋巴细胞3-4倍。核膜清晰,核染色质疏松呈网状。核内见明显核仁1-4个。胞浆丰富,嗜碱性,有伪足样突出。胞浆内有时可见小空泡。
细胞培养是一种无菌操作技术，要求工作环境和条件必须保证无微生物污染和不受其它有害因素的影响。细胞培养室和设计原则是防止微生物污染和有害因素影响，要求工作环境清洁、空气清新，干燥和无烟尘。细胞培养室的设计原则一般是无菌操作区设在室内较少走动的内侧，常规操作和封闭培养于一室，而洗刷消毒在另一室。
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在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸只分布在细胞膜脂质双层的内侧，细胞发生凋亡早期，膜磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V是一种磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。在细胞发生凋亡时，膜磷脂酰丝氨酸外翻的发生早于细胞核的变化，而此时Propidium Iodide（PI）不能通过细胞膜。
细胞坏死时，虽然也会发生磷脂酰丝氨酸外翻，但此时细胞膜的通透性明显增加，PI等核酸染料进入细胞与细胞核中的核酸结合，发出红色荧光。所以Annexin V-FITC(绿色荧光)常与鉴定细胞死活的核酸染料（如PI）合并使用，来区分凋亡细胞与死亡细胞。
技术原理及步骤
1. 离心收集细胞，微量离心机转速1000 rpm，离心时间5 min，弃培养基。
2. 用冷PBS洗涤细胞两次。
3. 用400 L1 Binding Buffer悬浮细胞，浓度大约为1 106 cells/mL。
4. 在细胞悬浮液中加入5 lLAnnexin V-FITC，轻轻混匀后于2~8 C避光条件下孵育15min。
5. 加入10 L PI后轻轻混匀于2~8 C避光条件下孵育5 min。
6. 在1小时内用流式细胞仪或荧光显微镜检测。
应用实例
应用领域
细胞的早期凋亡及区分凋亡与坏死细胞
服务周期
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