电泳图谱

电泳是一个很基础的实验，电泳图谱是通过电泳将一个混合物样品(如血清)在支持介质上分成区带。但须将电泳条经过染色，使区带显示出来而得电泳图谱。还可以进一步在光密度计上进行扫描而获得记录图谱。跑电泳看似简单，做块胶，上个样，插上电源，其实远没有这么简单。下面就给大家介绍下跑电泳及电泳图谱绘制容易遇到的一些问题和解决办法。

一、制作一块优质的琼脂糖凝胶

所谓“工欲善其事，必先利其器”，能否做一块好的琼脂糖凝胶，直接影响到后面的电泳和结果的分析。电泳的时候，会出现各种各样奇怪的图，给大家展示一下：

从图一上看，DNA电泳时，DNA条带好像遇到阻碍而发生了扭曲；图二中DNA亮带虽没有发生扭曲，但是却出现了杂斑亮带。这是因为在制胶时带入了其它杂质，形成了障碍物，使得DNA条带电泳时受到阻碍无法继续电泳，从而形成扭曲带（如图一）；或者是制胶时溶胶不完全以致琼脂糖颗粒残留，形成一些浓度较高的凝胶区域，在DNA电泳经过这些区域时，部分DNA被阻碍在这里而形成不规则亮带（如图二）。

“工欲善其事，必先利其器”，能否做一块好的琼脂糖凝胶，直接影响到后面电泳和结果的分析。制胶前，给大家的建议是：

1. 在制胶时必须将制胶模具、梳子以及烧杯等物品洗净，以免干胶及其他杂质带入；

2. 在溶胶时应观察溶液中是否有未溶解的琼脂糖颗粒，确保溶胶完全；

3. 在溶液倒入制胶模具前必须充分混匀，以免制出来的胶出现不均匀的现象。

二、选择合适浓度的琼脂糖凝胶

除了以上这种低级问题，还有一个容易忽略的问题，那就是凝胶的浓度。建议长片段的DNA选用低浓度的凝胶电泳，短片段的DNA则选用高浓度的凝胶电泳。比如：

以上这两幅电泳图是用相同的DNA Ladder、上样量、电泳电压并且跑了一样长的时间时，小新的内心是崩溃的！！！为啥差别非常明显？哪里不一样呢？就是由于采用了不同浓度的凝胶电泳而导致的。那怎么选择合适浓度的琼脂糖凝胶呢？简而言之，长片段的DNA选用低浓度的凝胶电泳，短片段的DNA则选用高浓度的凝胶电泳--具体参考方案参考下表：

三、选择合适的核酸上样量电泳

要想电泳跑出可见条带的话，至少需要上样50 ng，但是0.5 cm宽的梳子Z好不超过0.5μg的DNA量，因为上样量过多会造成加样孔超载，从而导致拖尾或弥散，对于较长的DNA此现象更为明显。另外，加样量的多少还应依据加样孔的大小及DNA片段的长度而定，当加样孔大时，样品上样量应相应加大。

四、选择合适的电压电泳

通常情况下电压越低，走出的电泳条带越平整。低电压电泳时，电泳缓冲液也不容易发烫，也能确保在电泳的过程中凝胶不会变形。当然电压太低，等待电泳结果的时间就会延长，综合考虑，一般控制电泳电压≤5V/cm，即可保证电泳条带的清晰度。

图七和图八是同一样本跑出的图，但是出来的效果差别非常大，主要是因为电泳时的电压不同。电泳图七由于电泳的电压过大，导致电泳条带都扭曲变形了(当实验使用GoldView Ⅱ型核酸染色剂时差别更明显）。通常情况下电压越低，走出的电泳条带越平整。低电压电泳时，电泳缓冲液也不容易发烫，也能确保在电泳的过程中凝胶不会变形。当然电压太低，等待电泳结果的时间就会延长，综合考虑，一般控制电泳电压≤5V/cm，即可保证电泳条带的清晰度。

五、选择合适的电泳距离（控制电泳时间）

Z后的这两幅图是同一块凝胶在电泳的不同时间段拍摄的电泳图。大家有没有觉得图九的电泳条带还行呢，有主带，虽然有弥散、拖尾条带，但是主带还是很亮的。如果只是看有没有核酸的话，差不多就蒙混过去了，但是如果你是想看DNA状态或者是分离不同长度片段的DNA，那么必须多跑一会儿，这样就有了图十。图十可以看出有基因组DNA、质粒DNA以及RNA。

为什么差别那么大？这是因为图九电泳的时间短，不同长度片段的DNA条带还未分离，都聚集在一起，所以只能看见DNA含量Z高的主带；而图十的电泳时间比较长，不同长度片段的DNA条带已经分离，可以清晰看到不同长度片段的DNA条带，甚至两Z下方的两条RNA条带都被分离开了。

当然对于一些片段的DNA，电泳20-30min家常便饭，有的甚至需要更长的时间，如果想稍微快一点，可以选用浓度比较稀的凝胶或稍微调高一点电压进行电泳，但是要有一定的范围

六、电泳图谱绘制与分析

根据聚丙烯酰胺凝胶薄片上蛋白质电泳带的粗细、深浅和迁移率，绘制电泳图谱，并计算相似率。

(一)迁移率计算

迁移率=(起点至蛋白带的距离/起点至指示剂前沿线的距离)×.

其中起点系指加样一端分离胶的起点线，指示剂前沿线指电泳结束时溴酚兰指示剂在胶板另一端形成的蓝色线。例如，某蛋白带的迁移距离是3cm，起点至指示剂前沿线距离是10cm，则该蛋白带的迁移率为0.3。比较两个菌株间的相似性时，迁移率差异小于0.03的两条蛋白带被视为相似的蛋白带。

(二)菌株间的相似率计算

相似率=(两菌株相似蛋白带的数目/两菌株蛋白带的总数)×.

例如，两个菌株间迁移率相似的蛋白带有5对(10条)，两菌株蛋白带总数为15条，则这两个菌株的相似率为67。相似率越高，菌株间的相似性越大。通常，同一个疫霉种菌株间的可溶性菌体蛋白质电泳图谱相似率在75~100之间。

为了提高蛋白质电泳结果的准确性，每一块胶板应同时用已知标准菌株与供试菌株一起电泳作为对照

2018-06-20 51795 热门标签： 凝胶电泳血红蛋白电泳毛细管电泳质粒电泳电泳涂装 上一篇 下一篇